·论　　著·

miR-34c对胶质瘤细胞增殖、凋亡和细胞周期影响的实验性研究

武震东1,2，任洪波2，孙志强2，刘　斌2，牛国栋2，焦保华1*

(1.河北医科大学第二医院神经外科，河北石家庄 050000；2.河北省邯郸市中心医院神经外科，河北邯郸 056000)

[摘要]　目的探讨miR-34c对人脑胶质瘤细胞株U251和U87增殖、凋亡和细胞周期的影响。方法应用脂质体将miR-34c导入胶质瘤细胞株U251和U87后，应用定量PCR验证转染效果，应用CCK-8法检测细胞增殖变化，流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期的改变。结果在U87和U251细胞系中，miR-34c-3p和miR-34c-5p的表达量明显小于正常胶质细胞系HEB。在U251细胞中，转染miR-34c-3p或miR-34c-5p后48、72、96 h，细胞存活率显著低于空白组和阴性对照组(P<0.05)。而在U87细胞中情况有所不同，转染miR-34c-3p后48、72、96 h，细胞存活率显著低于空白组和阴性对照组(P<0.05)；转染miR-34c-5p后24、48、72、96 h，细胞存活率显著低于空白组(P<0.05)，而与阴性对照组差异无统计学意义(P>0.05)。U251细胞高表达miR-34c-3p或miR-34c-5p，U87细胞高表达miR-34c-3p可以导致细胞停滞在S期，同时降低了G0/G1期的细胞数。在U251细胞中，凋亡细胞在空白组和阴性对照组分别占6.57%和6.3%，而转染miR-34c-3p或miR-34c-5p后凋亡细胞所占比例上升分别占28.49%和28.14%。但是在U87细胞中有所不同，仅转染miR-34c-3p后凋亡细胞数上升(3.56%)，而空白组、阴性对照组和转染miR-34c-5p组分别为1.53%、1.68%和1.91%。结论转染上调miR-34c在胶质瘤中的表达能够抑制其增殖，导致细胞周期在S期及G2/M期的停滞，诱导胶质瘤细胞的凋亡，为脑胶质瘤靶向治疗提供可靠的依据。但miR-34c-3p与miR34c-5p在不同细胞系中，影响细胞增殖能力、细胞周期变化及诱导细胞凋亡的效果有所不同，推测它们可能是通过不同靶点或机制起作用。

[关键词]　神经胶质瘤；微RNAs；细胞增殖；细胞凋亡　　doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.08.024

[收稿日期]2015-06-11；[修回日期]2015-07-21

[基金项目]河北省医学科学研究重点课题(ZD20140280)

[作者简介]武震东(1974-)，男，辽宁葫芦岛人，河北省邯郸市中心医院副主任医师，医学博士，从事神经外科疾病诊治研究。

通讯作者*。E-mail:jiaobp000@163.com

[中图分类号]　R730.264　　　[文献标志码]　B　　　

微小RNA(microRNA,miRNA)是一种约22个核苷酸长度非编码单链小RNA，其本身不具有翻译蛋白质的功能,通过与mRNA 的3′端非翻译区(3′UTR)碱基序列互补配对在转录后水平调控靶基因表达。miRNA与mRNA 能进行完全或近乎完全的互补配对，诱导对mRNA 的切割降解，而部分碱基配对则导致功能蛋白质的转录抑制[1]。最近有报道miRNA与肿瘤恶性程度及肿瘤患者的预后有密切关系[2]。亦有报道与正常组织比较，恶性肿瘤组织的miRNA异常表达[3]。MicroRNA-34c(miR-34c)在胶质瘤组织中广泛低表达，且随胶质瘤级别的升高，miR-34c-3p和miR-34c-5p的表达显著降低，miR-34c-3p和miR-34c-5p表达与胶质瘤级别呈负相关。本研究为胶质瘤细胞系U251和U87细胞转染miR-34c-3p和miR-34c-5p，上调其表达，检测miR-34c对人脑胶质瘤细胞增殖、细胞周期、凋亡等生物学特性的影响，旨在为胶质瘤的治疗开拓新的思路。

1　材料与方法

1.1　细胞株　胶质瘤细胞系U251和U87细胞购于中国科学院细胞库。正常人胶质细胞系HEB细胞购自中国科学院广州生物医药与健康研究院。

1.2　实验方法

1.2.1　细胞培养　U251用含10%胎牛血清(fetal calf serum,FBS)的DMEM-F12培养基，U87和HEB用含10%FBS的DMEM-高糖培养基培养，将符合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入37 ℃和5%CO2的培养箱内24～48 h后换液继续培养，换液的时间由细胞贴壁情况而定。培养U251、U87、HEB细胞达到指数生长期进行实验。利用脂质体介导的转染方法，将化学合成的miR-34c寡核苷酸转染到胶质瘤U87和U251细胞中，同时设立转染非特异性寡核苷酸片段的阴性对照组，使miR-34c基因有效的过表达。将未转染任何核苷酸链的胶质瘤U87和U251细胞为空白组。

1.2.2　细胞转染miRNA　转染采用脂质体转染试剂LipofectamineTM RNAiMAX转染试剂，用LipofectamineTM RNAiMAX转染miRNA(化学合成的成熟miRNA模拟物mimics浓度为50 nmol/L)到细胞内，转染时使用Opti-MEM培养基，转染后4 h换为细胞生长培养基(U251用含10%FBS的DMEM-F12培养基，U87和HEB用含10%FBS的DMEM-高糖培养基)。

1.2.3　定量PCR检测转染效果　利用RNA抽提试剂Trizol(Invitrogen， USA)提取收集细胞总RNA。取1 μg总RNA做茎环引物的逆转录反应。miR-34c-3p和 miR-34c-5p的共同逆转录引物为miRNA R：5′ CTCAACTGGTGTCGTGGA。PCR引物为hsa-miR-34c-3p F：5′ ACACTCCAGCTG-GGAATCACTAACCACACGG；hsa-miR-34c-5p F：5′ACACTCCAGCTGGGAGGCAGTGTAGTT-AGCTGAT。内参U6的引物为U6-F：5′CTCGC-TTCGGCAGCACA；U6-R：5′AACGCTTCACG-AATTTGCGT。所有引物均为上海生工生物工程公司合成。使用的定量PCR仪为ABI PRISM® 7500 Sequence Detection System。PCR扩增程序如下：95 ℃变形5 min，随后95 ℃作用15 s，65 ℃作用15 s，72 ℃作用32 s，共进行40个循环，在温度60～95 ℃进行融解曲线分析，每个样本重复3次。

1.2.4　细胞增殖-毒性检测(Cell Counting Kit-8，CCK-8)法检测细胞增殖能力　取转染后细胞进行下面实验。吹打散细胞，调整细胞浓度为1×105个/mL，分到96孔板，每孔100 μL，即每孔细胞为1×104个。等细胞半贴壁完全，收集各个时间点的细胞24、48、72、96 h加入CCK-8溶液细胞增殖检测试剂，比例为1∶10。即100 μL培养液加入10 μL检测液。在孵育4 h后，酶标仪读板光密度(optical delnsity，OD)490数据。细胞存活率=OD转染组/OD对照组。

1.2.5　细胞周期检测　细胞转染48 h后每样收集1×106细胞。离心收集细胞，弃上清，用预冷PBS洗细胞2次，加入预冷70%乙醇，于4 ℃固定过夜，或-20 ℃长期固定。离心收集细胞，以1 mL的PBS洗细胞1次，加入500 μL PBS含50 μg/mL溴化丙锭(propidiumiodide，PI)，100 μg/mL核糖核酸酶A(Ribonuclease A,RNase A)，0.2%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100),4 ℃避光孵育30 min。以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2～3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。

1.2.6　细胞凋亡检测　细胞转染48 h后，将细胞培养板中各组细胞的培养基分别转移到15 mL的锥形管中并置于冰上。用2 mL PBS溶液轻轻润洗培养板内细胞，去除PBS溶液，加入0.5 mL 0.25%不含EDTA的胰酶孵育，直到显微镜下观察到细胞开始从培养板壁脱落。轻轻连续拍打使细胞从培养板壁上完全脱落，将细胞轻轻重悬于预冷的1×结合缓冲液中使得其密度为1×106细胞/mL，将0.5 mL细胞悬液从细胞培养板中(5×105个细胞)转移到1个干净的离心管内，加入1.25 μL 细胞凋亡检测试剂Annexin V-FITC，室温(18～24 ℃)避光反应15 min，室温1 000 g 离心5 min，去除上清，将细胞用0.5 mL预冷的1×结合缓冲液轻轻重悬，加入10 μL PI，立即用流式细胞仪检测分析。

1.3　统计学方法　应用SPSS 16.0统计学软件进行数据分析。计量资料以±s表示，分别采用单因素方差分析、LSD-t检验和重复测量设计资料的方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2　结　　果

2.1　定量PCR检测miR-34c-3p和miR-34c-5p的转染效果　在U87和U251细胞系中，miR-34c-3p和miR-34c-5p的表达量要明显小于正常胶质细胞系HEB(图1，2)。而转染了miR-34c-3p或miR-34c-5p的U87和U251细胞，其miR-34c-3p的表达量明显高于空白组(P<0.05，图1)和阴性对照(P<0.05)。该结果确定了miRNA确实转染成功。

2.2　转染miR-34c抑制胶质瘤细胞的增殖能力　在U251细胞中，转染miR-34c-3p或miR-34c-5p后48、72、96 h，细胞存活率显著低于空白组(P<0.05)和阴性对照组(P<0.05)(图3)。而在U87细胞中情况有所不同，转染miR-34c-3p后48、72、96 h，细胞存活率显著低于空白组(P<0.05)和阴性对照组(P<0.05)；转染miR-34c-5p后24、48、72、96 h，细胞存活率显著低于空白组(P<0.05)，而与阴性对照组差异无统计学意义(P>0.05)(图4)。

2.3　转染miRNA-34c后细胞周期的变化　在U251细胞中，空白组和阴性对照组细胞的G0/G1期分别占72.7%和73.44%，而转染miR-34c-3p或miR-34c-5p后，其G0/G1期分别降至44.24%和43.58%。而空白组和阴性对照组细胞的G2/M期分别仅占4.4%和4.31%，转染miR-34c-3p或miR-34c-5p后，其G2/M期分别升至21.6%和21.83%。S期与G2/M期相似，转染后所占比例上升(图5)。在U87细胞中，空白组和阴性对照组细胞的G0/G1期分别占69.3%和75.62%，转染miR-34c-3p后，其G0/G1期降至44.05%，而转染miR-34c-5p却不能影响G0/G1期(79.07%)。空白组和阴性对照组细胞的S期分别占20.66%和13.61%，转染miR-34c-3p后，其S期升至48.83%，但转染miR-34c-5p同样不能影响S期(11.04%)。G2/M期在4组中所占比例差异无统计学意义(图5)。该实验证实了U251细胞高表达miR-34c-3p或miR-34c-5p，U87细胞高表达miR-34c-3p可以导致细胞停滞在S期，同时降低了G0/G1期的细胞数。细胞周期的变化说明miR-34c可能通过抑制细胞周期中的某个通路以达到抑制细胞增殖的目的。

2.4　转染miRNA-34c后诱导胶质瘤细胞的凋亡　根据流式细胞仪的结果，Annexin V和PI双阳性的细胞即为凋亡细胞。在U251细胞中，凋亡细胞在空白组和阴性对照组分别占6.57%和6.3%，而转染miR-34c-3p或miR-34c-5p后凋亡细胞所占比例上升分别占28.49%和28.14%。但是在U87细胞中有所不同，仅转染miR-34c-3p后凋亡细胞数上升(3.56%)，而空白组，阴性对照组和转染miR-34c-5p组分别为1.53%，1.68%和1.91%(图6)。

图1　实时定量PCR检测正常胶质细胞系HEB、U251和U87细胞系中miR-34c-3p的表达

*P<0.05为miR-34c-3p组与空白组比较　#P<0.05为miR-34c-3p组与阴性对照组比较　△P<0.05为空白组与HEB比较(LSD-t检验)

图2　实时定量PCR检测正常胶质细胞系HEB、U251和U87细胞系中miR-34c-5p的表达

*P<0.05为miR-34c-5p组与空白组比较　#P<0.05为miR-34c-5p组与阴性对照组比较　△P<0.05为空白组与HEB比较(LSD-t检验)

图3　转染miR-34c-3p或miR-34c-5p后，U251细胞的生存率

*P<0.05为转染组与空白组比较　#P<0.05为转染组与阴性对照组比较(重复测量设计资料的方差分析)

图4　转染miR-34c-3p或miR-34c-5p后，U87细胞的生存率

*P<0.05为转染组与空白组比较　#P<0.05为转染组与阴性对照组比较(重复测量设计资料的方差分析)

图5　转染miRNA-34c-3p或miR-34c-5p后，细胞的细胞周期情况

A.U251细胞；B.U87细胞

图6　转染miR-34c-3p或miR-34c-5p后，细胞的凋亡情况

A.U251细胞；B.U87细胞

3　讨　　论

肿瘤的发生是细胞增殖、凋亡和分化失衡的结果。越来越多的研究证实许多miRNA具有促进细胞增殖和存活的作用，同时还有许多miRNA具有抑制细胞增殖和存活的作用，这两类miRNA作为癌基因和抑癌基因在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要的作用[4-5]。说明将miRNA作为肿瘤治疗的靶标是可行的。在近期的研究中，miR-34异常表达抑制细胞分化、克隆形成，使细胞周期阻滞在G1期[6-7]。并且，miR-34a的再表达诱导了细胞的凋亡[8]。miR-34介导的细胞凋亡能够被p53基因的失活所抑制。miR-34a靶向一些mRNA，如SIRT1(Sirtuin type 1)、Bcl-2(B-cell lymphoma-2)、N-myc、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)，抑制这些基因转录[6,9-10]。最近有报道，miR-34c能够抑制血管平滑肌细胞的增殖[11]。

恶性胶质瘤是神经系统常见的肿瘤。miR-34c在人类恶性胶质瘤组织和多种细胞系中低表达。本研究利用多种细胞生物学方法，进一步探讨miR-34c对胶质瘤U87和U251细胞系的生物学功能，以便为胶质瘤的治疗寻找新的靶标。本研究首先检测转基因细胞对胶质瘤细胞增殖的影响，利用经典的CCK-8实验对细胞进行检测，结果显示转染了miR-34c-3p或miR-34c-5p的细胞能够明显减弱细胞的增殖，但U87细胞中miR-34c-5p与其阴性对照组比较差异无统计学意义，也就是说miR-34c-5p的抑制增殖作用比较弱，猜测在U87细胞中miR-34c-5p对细胞的抑制机制可能与miR-34c-3p有所不同。细胞周期是指一个母细胞分裂形成的细胞到下一次再分裂形成2个子细胞的时期，分为间期(G1、S、G2期)和有丝分裂期(M期)。本研究采用流式细胞仪分析转染miR-34c-3p或miR-34c-5p后细胞周期的变化，发现转染后的U251细胞多停滞在S期及G2/M期，而仅转染了miR-34c-3p的U87细胞多停滞在S期，转染了miR-34c-5p的U87细胞周期变化与空白组和阴性对照组差异无统计学意义，表明miR-34c-5p抑制U87细胞的机制与miR-34c-3p不同，这也进一步佐证了细胞增殖能力的结果。凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料，如PI有抗染性，细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。本研究结果显示，转染miR-34c-3p或miR-34c-5p的U251细胞的凋亡率明显增高，而转染miR-34c-3p或miR-34c-5p的U87细胞凋亡率变化不大。

从体外实验数据看出，miR-34c-3p和miR-34c-5p能够抑制胶质瘤细胞增殖，导致细胞周期停滞在S期及G2/M期，诱导胶质瘤细胞的凋亡，大胆推测miR-34c-3p和miR-34c-5p在胶质瘤中扮演抑癌的角色，但miR-34c-3p与miR-34c-5p在不同细胞系中，影响细胞增殖能力、细胞周期变化及诱导细胞凋亡的效果有所不同，推测它们可能是通过不同靶点或机制起作用，有待于在以后的实验中继续探讨miR-34c-3p和miR-34c-5p在胶质瘤的作用机制。

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