苯酚-硫酸比色法测定三黄糖敏汤中总多糖含量

(1.河北省石家庄市第一医院药学部，河北石家庄 050011；2.河北医科大学药学院药物分析教研室，河北石家庄 050017；3.河北省石家庄市第一医院中医科，河北石家庄 050011)

[摘要]　目的建立三黄糖敏汤中总多糖含量测定方法。方法以葡萄糖为对照品，采用苯酚-硫酸比色法，在490 nm处测定吸光度。结果葡萄糖浓度在2.95～8.85 mg/L范围内与吸光度呈良好的线性关系(r=0.999 3)；平均回收率为98.1%，相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)为2.7%，测得三黄糖敏汤中总多糖含量为5.9 g/L，RSD为2.9%。结论该方法简便准确、稳定可靠，可作为该制剂中总多糖含量的测定方法。

[关键词]　三黄糖敏汤；多糖类；质量控制　　doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.08.036

[作者简介]靳淑敏(1972-)，女，天津人，河北省石家庄市第一医院副主任药师，医学硕士，从事临床药学研究。

三黄糖敏汤由黄芪、黄精、黄连、枸杞、知母、桑叶、麦冬、水蛭、荔枝核九味中药组成，临床上主要用于改善胰岛素抵抗症状，增加胰岛素敏感性，可联合二甲双胍治疗2型糖尿病胰岛素抵抗症状[1]。该方黄芪、黄连、黄精等均含有大量的多糖类有效成分，多糖具有降血糖、降血脂、抗血栓、抗溃疡、抗肝炎、抗肿瘤、延缓衰老、免疫调节等功能[2-5]。已报道的多糖含量测定方法有苯酚-硫酸比色法、蒽酮-硫酸比色法、高效液相色谱法、气相色谱法[6-9]等，其中苯酚-硫酸比色法常用于总多糖的测定。目前，三黄糖敏汤中总多糖的含量测定方法尚未见报道。本实验建立苯酚-硫酸比色法测定三黄糖敏汤中总多糖含量的方法，旨在为该制剂的有效质量控制和药理作用机制的深入研究奠定基础。

1　材料与方法

1.1　仪器与试剂　TU-1901双光束紫外可见分光光度计；BP211D型分析天平；离心机；恒温水浴。葡萄糖对照品(分析纯，天津市百世化工有限公司，批号20101116)，浓硫酸、苯酚、无水乙醇均为分析纯。

1.2　三黄糖敏汤的制备　分别称取枸杞2.0 g，荔枝核1.8 g，黄连1.2 g，麦冬2.0 g，黄芪3.0 g，黄精3.0 g，知母1.2 g，桑叶2.0 g，共16.2 g，加10倍量水，浸泡30 min，煎煮60 min，趁热用纱布滤过；残渣加8倍量水，煎煮60 min，趁热用纱布滤过；合并2次煎煮液，浓缩至100 mL，即得。

1.3.1　对照品溶液的制备　取105 ℃干燥至恒重的葡萄糖对照品0.1 g，精密称定，置100 mL量瓶中，加水制成对照品储备液。精密量取对照品储备液10.0 mL置100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液(每1 mL中含无水葡萄糖0.1 mg)。

1.3.2　供试品溶液的制备　取三黄糖敏汤1.5 mL，离心(14 000 r/min)10 min，离心2次。取上清液1.0 mL，加无水乙醇9.0 mL，使醇含量为90%，4 ℃静置24 h，离心(10 000 r/min)10 min，弃去上清液，残渣挥干乙醇，用适量水溶解，并定容至100 mL，摇匀，过滤，即得。

1.3.3　6%苯酚溶液的制备　称取苯酚6 g，置100 mL棕色量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

1.4.1　测定波长的确定　精密量取对照品溶液0.6 mL，置15 mL试管中，精密加入6%苯酚溶液1.0 mL，摇匀，迅速精密加入浓硫酸5.0 mL，摇匀，置40 ℃水浴中反应30 min取出，冷却至室温，以相应的试剂为空白，在400～760 nm的波长范围内进行扫描，确定最大吸收波长。

1.4.2　硫酸用量的考察　精密量取对照品溶液0.6 mL 4份，分别置15 mL试管中，各精密加入6%苯酚溶液1.4 mL，摇匀，迅速精密加入浓硫酸3.0、4.0、5.0、6.0 mL，摇匀，置40 ℃水浴中反应30 min取出，冷却至室温，分别补水至8.0 mL，冷却至室温，以相应的试剂为空白，在确定的最大吸收波长处测定吸光度，确定硫酸的最佳用量。

1.4.3　苯酚用量的考察　精密量取对照品溶液0.6 mL 5份，分别置15 mL试管中，各精密加入6%苯酚溶液0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，摇匀，分别加水补至2.0 mL，迅速精密加入浓硫酸5.0 mL，摇匀，置40 ℃水浴中反应30 min取出，冷却至室温，以相应的试剂为空白，在确定的最大吸收波长处测定吸光度，确定苯酚的最佳用量。

1.4.4　水浴时间的考察　精密量取对照品溶液0.6 mL 5份，分别置15 mL试管中，各精密加入6%苯酚溶液1.2 mL，摇匀，迅速精密加入浓硫酸5.0 mL，摇匀，置40 ℃水浴中分别反应15、20、25、30、35 min取出，冷却至室温，以相应的试剂为空白，在确定的最大吸收波长处测定吸光度，确定最佳水浴时间。

1.5.1　标准曲线及线性范围　精密量取对照品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL分别置15 mL试管中，分别加水0.4、0.3、0.2、0.1、0.0 mL，各精密加入6%苯酚1.2 mL，摇匀，迅速精密加入浓硫酸5.0 mL，摇匀，置40 ℃水浴中反应25 min取出，冷却至室温，以相应的试剂为空白，在490 nm处测定吸光度。以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，采用偏最小二乘法在Excel中进行线性回归，绘制标准曲线。

1.5.2　精密度试验　精密量取0.6 mL对照品溶液，分别置15 mL试管中，按“1.5.1”中的方法，测定吸光度，连续测定6次，计算相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)。

1.5.3　稳定性试验　精密量取0.6 mL供试品溶液，分别置15 mL试管中，按“1.5.1”中的方法操作，于室温下分别放置10、20、30、40、50、60 min，依法测定吸光度，计算RSD。

1.5.4　重复性试验　精密量取0.6 mL供试品溶液6份，分别置15 mL试管中，按“1.5.1”中的方法，测定吸光度，计算含量测定结果的RSD。

1.5.5　加样回收试验　精密量取0.4 mL已知含量的供试品溶液6份，分别置15 mL试管中，精密加入0.2 mL对照品溶液，按“1.5.1”中的方法测定吸光度，计算回收率。

1.5.6　样品测定　精密量取0.6 mL供试品溶液3份，按“1.5.1”中的方法测定吸光度，代入标准曲线计算供试品溶液中总多糖(按葡萄糖计)含量。

2　结　　果

2.1　显色条件的确定　结果表明，对照品溶液在490 nm处有最大吸收，故确定490 nm为测定波长。浓硫酸由3.0 mL增至6.0 mL，吸光度值在5.0 mL达到最大值，故确定硫酸用量为5.0 mL。苯酚由0.6 mL增至1.4 mL，吸光度值在1.2 mL达到最大，故确定6%苯酚的用量为1.2 mL。水浴时间在35 min之内，吸光度值在25 min时最大，故确定水浴时间为25 min。因此，最终确定的最佳显色条件为6%苯酚1.2 mL，浓硫酸5.0 mL，40 ℃反应25 min，最佳测定波长为490 nm。

2.2　方法学验证　回归方程为A=0.0769 C-0.0288(r=0.999 3)，表明葡萄糖浓度在2.95～8.85 mg/L范围内与吸光度呈现良好的线性关系。精密度试验测定结果的RSD为0.7%(n=6)，表明该仪器精密度良好。稳定性试验测定结果的RSD为0.8%，表明供试品溶液至少在1 h内稳定。重复性试验测定结果的RSD为3.4%(n=6)，表明该法重复性良好。供试品溶液的平均回收率为98.1%，RSD为2.7%(n=6)，符合含量测定要求，表明该方法准确可靠。见表1。

2.3　样品测定　样品中总多糖含量(以葡萄糖计)均值为5.9 g/L，RSD为2.9%(n=3)，见表2。

表1　供试品加样回收试验结果　(n=6)

表2　样品含量测定结果　(n=3)

3　讨　　论

近年来对多糖提取工艺的研究方法很多，如水提醇沉法、酸提取法、碱提取法、酶提取法[10]、超声提取法[11]、半仿生提取法[12]等。多糖是由单糖基通过糖苷键连接而成的化合物，在稀酸、稀碱条件下易使多糖发生糖苷键的断裂，部分多糖发生水解而使多糖的提取率减少，而且服用中药一般是用热水煎煮，因此本实验采用水提醇沉法提取多糖[13]。

水提醇沉法利用多糖不溶于高浓度乙醇的性质，常采用高浓度乙醇沉淀提纯多糖。由于不同性质或不同相对分子质量的多糖沉淀所需乙醇浓度不同，本实验对75%、80%、85%、90%不同乙醇浓度进行了比较，确定最佳乙醇浓度为90%。

苯酚-硫酸比色法测定多糖的原理是多糖被浓硫酸水合产生的高温迅速水解产生单糖，并迅速脱水生成糠醛衍生物，再与苯酚生成橙色衍生物，在适当波长下和一定浓度范围内，吸光度与糖浓度呈线性关系，从而可比色测定其含量[14]。该方法通过多糖水解而后定量反应生成有色化合物，从而间接测定多糖的含量，涉及水解和呈色反应，所受影响因素较多，因此合适的测定条件为本实验成功的关键。故本实验针对影响反应的关键因素——试剂用量和反应时间进行了考察，苯酚-硫酸比色法测定多糖含量，为防止试剂与空白的污染，操作时应注意避免在试管壁同一位置加入不同种试剂；另外，为保证测定结果的重复性，测定时应严格控制混匀时间、水浴时间和水浴温度。

通过线性、精密度、稳定性、重复性和加样回收率试验等方法学考察及样品含量测定，表明所建立的苯酚-硫酸比色法测定三黄糖敏汤中总多糖含量简便准确、实际应用性良好，可用于该产品的质量控制。

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本刊2015年第36卷第7期768～771页“降钙素原下降率对脓毒血症治疗及预后评估的意义”一文，将作者高勇“河北省医学科学研究重点课题计划”编号“ZD20140378”错标为“ZD2014037”，特向作者致歉。

苯酚-硫酸比色法测定三黄糖敏汤中总多糖含量

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

1　材料与方法

2　结　　果

3　讨　　论