·论 著·
张亚坤，王伟美，贡 莹，张 欢，张志清*(河北医科大学第二医院药学部，河北 石家庄 050000)
[摘要] 目的观察连续服用酒石酸美托洛尔(metoprolol tartrate,MT)片6 d后大鼠体内药动学变化。方法将40只大鼠随机分为2组各20只。实验组灌胃酒石酸MT 27 mg/kg 每天1次，连续6 d；对照组灌胃等量蒸馏水每天1次，连续6 d。2组于第7天同时灌胃酒石酸MT(27 mg/kg)后5 h内眼内眦取血，血浆样品处理后用超高效液相色谱法(ultra performance liquid chromatography，UPLC)测定并绘制药时曲线，并用DAS 2.1.1 软件拟合药动学参数，采用SPSS 13.1软件对2组药动学参数进行统计学分析。结果实验组与对照组主要药动学参数：血药浓度时间曲线下面积(area under curve，AUC)(0～5 h)分别为(0.84±0.40) mg·h(-1)·L(-1)和(0.96±0.46) mg·h(-1)·L(-1)；AUC(0～∞)分别为(0.91±0.41) mg·h(-1)·L(-1)和(1.05±0.50) mg·h(-1)·L(-1)；药物消除半衰期(half life,t(1/2))分别为(1.23±0.36) h和 (1.42±0.41) h；达峰时间(T(max))分别为(0.51±0.10) h和(0.85±0.28) h；表观分布容积(V)分别为(58.19±22.61) L/kg和(61.54±30.55) L/kg；血浆清除率(plasma clearance,CL)分别为(33.94±13.59) L·h(-1)·kg(-1)和(30.07±11.20) L·h(-1)·kg(-1)；血药峰浓度(peak concentration,C(max))分别为(0.71±0.40) mg/L和(0.64±0.35) mg/L。2组间T(max)和C(max)差异有统计学意义，其他药动学参数AUC(0～5 h)、AUC(0～∞)、t(1/2)、CL、V差异无统计学意义(P>0.05)。结论连续灌胃酒石酸MT片6 d后，其在大鼠体内未见蓄积且达峰时间缩短。
[关键词] 美托洛尔；药代动力学；超高效液相色谱法；大鼠
doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.03.016
美托洛尔(metoprolol tartrate,MT)是心脏选择性β受体阻滞剂，缺乏内在拟交感活性，有较弱的或没有膜稳定活性[1]。临床上用于治疗高血压、心绞痛、心律失常、心肌梗死和心力衰竭，也用于甲状腺功能亢进症的治疗和偏头疼的预防[2-7]。酒石酸MT作为临床常用药物，用于治疗高血压、心绞痛等心血管疾病时通常需要长期或者终身服用。近年来对酒石酸MT基因多态性方面的研究较多[8-14]，而对其长期治疗后的心血管效应及长期服用在药代动力学方面的研究较少。本研究通过比较服用酒石酸MT6 d前后大鼠体内药代动力学的变化，旨在为酒石酸MT长期服用的心血管效应提供有力的依据。
1.1 材料
1.1.1 仪器 ACQUITY UPLC® BEH C18色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm，美国Waters公司)；Waters Acquity UPLC 系统，包括四元梯度泵、恒温自动进样器、柱温箱、紫外检测器和Waters Empower 3 软件操作平台(美国Waters公司)；涡旋混合器(XW-80A，上海医科大学仪器厂)；冷冻离心机(GL-20G-Ⅱ，上海安亭科学仪器厂)；低温冰箱(MDF-U2086S，日本SANYO)；数控恒温水浴氮吹仪(KL512J，北京康林科技有限公司)；抽滤泵(天津市协同仪器有限公司)；电子分析天平(CPA225D，德国Sartorius)；电子天平(HZF-B1200/0.1 g，美国华志)；超声波清洗器(KQ-300B，昆山市超声仪器有限公司)；台式酸度计(哈纳pH 213，罗马尼亚)。
1.1.2 药品与试剂 酒石酸MT对照品(中国食品药品检定研究院，批号100084-201403)；拉莫三嗪对照品(内标，中国药品生物制品检定所，批号100775-200401)；酒石酸MT片(阿斯利康制药有限公司，规格25 mg，批号1409028)；磷酸二氢钾(分析纯，北京市红星化工厂，批号970225-1)；磷酸(分析纯，天津市永大化学试剂开发中心出品，批号20041122)；乙酸乙酯(分析纯，天津市永大化学试剂开发中心出品，批号20041202)；甲醇(质谱纯，赛默飞世尔科技有限公司，批号130701)；高纯氮气(含量99.9%，石家庄京联实用气体有限公司，批号20141124)；蒸馏水(深圳屈臣氏蒸馏水有限公司)。
1.1.3 实验动物 健康Wistar大鼠，清洁级，雄性，体质量(200±20)g，河北省动物实验中心提供，动物许可证编号：SCXK(冀)2014-12-009。
1.2 实验方法
1.2.1 色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLC® BEH C18色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；流动相：甲醇-0.01 mol/L磷酸二氢钾缓冲盐(磷酸调节pH 3.6)(31∶69，V/V)；流速：0.36 mL/min ；检测波长：225 nm；柱温：30 ℃；进样量：2 μL；内标：拉莫三嗪。
1.2.2 血浆样品处理 取血浆样品0.2 mL于1.5 mL离心管中，加入内标溶液(2.50 mg/L液)20 μL混匀，加入提取剂乙酸乙酯1 mL，涡旋振荡1 min，离心2 min(转速10 800 r/min，离心半径50 mm)，取上层清液于1.5 mL离心管中，40 ℃水浴氮气吹干，100 μL流动相复溶，取2 μL进样。
1.3 方法学评价
1.3.1 专属性 取空白血浆，MT和内标拉莫三嗪对照品溶液，给药后大鼠血浆样品经超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography,UPLC)法分析测定，MT和拉莫三嗪的保留时间为1.45 min、1.75 min。MT与峰形良好，分离完全，大鼠血浆中内源性物质不干扰MT的测定。
1.3.2 标准曲线与最低检测限 在空白血浆180 μL中加入MT对照品溶液，分别制备血药浓度为2.00、1.00、0.500、0.250、0.125、0.062 5、0.031 3 mg/L的血浆样品。按“血浆样品处理”操作，以MT峰面积和内标峰面积比(Y)为纵坐标，以所对应各点的血药浓度(X)为横坐标，经最小二乘法线性回归，得标准曲线回归方程为：Y=1.358X+0.006(r=0.999 5)。线性范围：0.031 3～2.00 mg/L。最低检测限为0.01 mg/L。
1.3.3 精密度与回收率 制备3种浓度(0.062 5 mg/L，0.500 mg/L，2.00 mg/L)的血浆质控样品各5份，分别于1 d及连续5 d(每天1次)按“血浆样品处理”操作后进样测定考察日内精密度及日间精密度。同法，依据标准曲线计算检测量，以检测量与加入量的比计算相对回收率， 见表1。
表1 回收率和精密度实验结果
Table 1 Results of recovery and precision tests
1.3.4 稳定性 制备3种浓度(0.0625 mg/L，0.500 mg/L，2.00 mg/L )的血浆质控样品各5份，分别考察质控样品在室温放置4 h、反复冻融3次及-40 ℃冻存5 d的稳定性，其相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)值分别为1.62%、5.43%、1.11%，均<10%，表明在上述条件下MT的稳定性良好。
1.4 药动学实验 取Wistar大鼠40只，随机分为2组，每组20只，实验组灌胃酒石酸MT(27 mg/kg)每天1次，连续6 d；对照组灌胃等量蒸馏水每天1次，连续6 d。2组于第7天同时灌胃酒石酸MT(27 mg/kg)后分别于0、0.17、0.33、0.5、0.75、1、1.5、2、2.5、3、4、5 h眼内眦取血0.5 mL于装有肝素钠抗凝的离心管中，离心5 min(转速10 800 r/min，离心半径50 mm)取上层血浆，-40 ℃冰箱保存待测。
1.5 统计学方法 应用DAS 2.1.1软件对每只大鼠的血药浓度-时间数据进行拟合，并计算主要药代动力学参数。应用SPSS 13.1软件对2 组的药动学参数进行统计学分析，其中满足正态分布的进行t检验，不满足正态性的进行非参数检验。P<0.05为差异有统计学意义。
血浆样品自然解冻后按“血浆样品处理”操作，UPLC法测定，根据标准曲线方程计算血药浓度并绘制各组平均血药浓度-时间曲线(图1)。结果显示，实验组达峰时间(Tmax)和血药峰浓度(Cmax)明显短于或小于对照组，实验组和对照组的其他药动学参数如血药浓度时间曲线下面积(area under curve，AUC)0-5 h、AUC0-∞、t1/2、CL、表观分布容积(V)差异并无统计学意义(P>0.05)，见表2。
图1 对照组与实验组平均药-时曲线
Figure 1 Average plasma concentration-time curve in control group and test group
表2 大鼠体内酒石酸MT的药代动力学参数
Table 2 The pharmacokinetic parameters of metoprolol tartrate in rats
文献中常用高效液相色谱[15]法和液相色谱半联色谱[16]法测定酒石酸MT的血药浓度。本研究采用UPLC法测定大鼠血浆中酒石酸MT的血药浓度，与文献中常用方法比较具有费用低、仪器易得、操作简便、分析速度快、灵敏度高、节省试剂等优点。全面的方法学验证后，证明所建立的方法专属性、精密度、准确度、灵敏度均较好，适用于连续给药 6 d前后大鼠体内酒石酸MT药动学变化的研究。
本研究结果显示稳态前后AUC0～5h、AUC0～∞、t1/2、CL、V差异并无统计学意义，表明连续灌胃大鼠酒石酸MT 6 d后达峰时间缩短，但体内并未存在蓄积现象，对大鼠体内药动学无显著影响；实验组Tmax明显短于对照组，表明稳态前的达峰时间明显长于稳态后，造成这一结果的原因可能是因为第3次给药前体内药物尚未消除完全，随着不断给药，体内药物量不断增加，达峰所用时间变短。
酒石酸MT在临床上治疗高血压类心血管疾病时通常需要长期或者终身服用，本研究通过观察稳态前后酒石酸MT在大鼠体内药动学变化，为其在人体内的药动学变化以及合理用药提供了有力的依据。
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(本文编辑：许卓文)
ZHANG Ya-kun, WANG Wei-mei, GONG Ying, ZHANG Huan, ZHANG Zhi-qing*
(Department of Medicine, the Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000, China)
[Abstract] Objective To investigate the changes of continuous administration of metoprolol tartrate tablets in six days on the pharmacokinetic of in rats. Methods Forty rats were randomly divided into two groups with 20 rats in each group. Each rat in the test group was given metoprolol tartrate(27 mg/kg ), and each rat in the control group was given equal volume of distilled water orally，twice daily for 6 days. On day 7， each rat in two groups recieved a single dose of metoprolol tartrate(27 mg/kg). Blood samples were taken at different times after administration from the inner canthus. The concentrations of metoprolol tartrate were determined by ultra performance liquid chromatography(UPLC). The pharmacokinetic parameters of the two groups were calculated with DAS 2.1.1 pharmacokinetic software and were compared with SPSS 13.1 software. Results The main pharmacokinetic parameters in the test group and control group:area under curve(AUC)(0-5 h) were(0.84±0.40) mg·h(-1)·L(-1) and(0.96±0.46) mg·h(-1)·L(-1), respectively; AUC(0-∞) were(0.91±0.41) mg·h(-1)·L(-1) and(1.05±0.50) mg·h(-1)·L(-1), respectively; half life(t(1/2)) were(1.23±0.36) h and(1.42±0.41) h, respectively; T(max) were(0.51±0.10) h and(0.85±0.28) h, respectively; V were(58.19±22.61) L/kg and(61.54±30.55) L/kg, respectively; plasma clearance(CL) were(33.94±13.59) L·h(-1)·kg(-1) and(30.07±11.20) L·h(-1)·kg(-1), respectively; peak concentration(C(max)) were(0.71±0.40) mg/L and(0.64±0.35) mg/L, respectively. There were no significant differences in parameters of AUC(0-5 h), AUC(0-∞), t(1/2), CL,V between control group and test group(P>0.05). There were significant difference in T(max) and C(max) between two groups.Conclusion There has no accumulation and T(max) was shortened in rats given metoprolol tartrate for six days.
[Key words] metoprolol tartrate; pharmacokinetics； ultra performance liquid chromatography; rats
[中图分类号] R971.94
[文献标志码] A
[文章编号] 1007-3205(2016)03-0309-04
[作者简介]张亚坤(1981-)，女，河北石家庄人，河北医科大学第二医院主管药师，医学硕士，从事临床药学研究。*通讯作者。E-mail:zhangzhq@medmail.com.cn
[收稿日期]2015-06-30；[修回日期]2015-07-21