·综 述·
孔祥凤(综述)，韦金英，段惠军*(审校)
(河北医科大学基础医学院病理学教研室，河北 石家庄 050017)
[关键词] 糖尿病肾病；自噬；综述文献
doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.04.031
糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)作为糖尿病最常见并发症之一，发病机制复杂，严重危及糖尿病患者的生命健康。研究发现自噬与DN的发生存在一定的关联性；然而，相关基础研究仅处于认识阶段，仍需进一步深入探讨。因此，对DN发病机制及有效治疗方法的研究已经成为代谢性疾病领域的重要研究课题。近年来，随着糖尿病发病率在全球范围内呈逐渐增长趋势，糖尿病已经成为威胁人类生命健康的主要问题。2013年全世界糖尿病患者已达3.82亿，以这样的增长速度，到2035年总人数将达到5.92亿[1]。DN是由糖尿病而引发的十分常见的严重并发症，作为终末期肾病的主要元凶之一，其发病机制错综复杂，因此探索DN的有效治疗方法成为一个备受关注的问题。现就DN中自噬主要营养信号通路，自噬与细胞内新陈代谢和细胞内活动变化关系，包括氧化应激、糖基化终末产物、缺氧、内质网应激等综述如下。
自噬是由Ashford等[2]在1962年发现细胞内有“自己吃自己”的现象后提出的，是指从粗面内质网的无核糖体附着区脱落的双层膜包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等成分形成自噬体，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新过程,从而维持细胞内的稳态及细胞的完整性，在动物疾病的发生发展中起着重要的作用[3]。细胞在饥饿、能量不足等应激状态下，通过自噬降解长寿命蛋白为三磷酸腺苷(association of tennis professionals,ATP)合成提供必要氨基酸，保证细胞内基本物质和能量需求，对于溶酶体降解并维持细胞内平衡和细胞完整性具有重要的作用。
自噬是最初在酵母菌中发现的一个协调自噬相关基因(autophagyassociatedgene,Atg)的多步骤过程。自噬诱导阶段涉及Ulk1/2复合体，由Ulk1/2、Atg13和黏着斑激酶家族相互作用蛋白200(focal adhesion kinase family interacting protein of 200,FIP200)组成。自噬起始阶段通过激活Ulk1/2，磷酸化Atg13和FIP200，启动自噬[4]。继而自噬相关基因Beclin-1从Beclin-Bcl2解离出来，与人空泡分选蛋白34蛋白(human vacuolar protein sorting 34 protein，hVps34)、hVps15和Atg14组成Ⅲ类磷脂酰肌醇-3激酶复合体，促进囊泡成核与自噬泡形成[5]。自噬延伸阶段涉及2个独立泛素结合系统：第一系统是Atg12与Atg5、自噬相关16样蛋白1(Atg16L1)在Atg7和Atg10连接酶作用下形成复合体；第2个系统是Atg 4与Atg16L1在Atg 7和Atg 3连接酶作用下形成复合体，然后与微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein1 lightchain3，LC3)发生泛素化结合反应[6-7]。LC3分为LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ，泛素化LC3-Ⅰ与磷脂酰乙醇结合形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ存在于自噬体膜上。因此，自噬体膜上LC3-Ⅱ标志着自噬体形成。自噬的成熟阶段是紫外辐射抗性相关基因蛋白与C类分选空泡蛋白复合体作用，Ras相关蛋白7激活并促进自噬体和溶酶体的融合形成自噬溶酶体，溶酶体内相关水解酶降解内容物，通透酶运输产物到细胞质再循环利用。
自噬可以通过调控营养物质敏感信号通路来改善肾脏的自噬功能，在DN的发病机制中发挥着重要的作用,有望成为DN治疗新的药理靶点。目前发现的自噬主要有3种类型：巨自噬、微自噬和分子伴侣介导的自噬。本研究主要讨论的是巨自噬，巨自噬就是通常所指的自噬[8]。巨自噬是由内质网、线粒体等脱落的单层膜凹陷形成双层膜样的隔离膜，包裹细胞质成分形成自噬体，再与溶酶体融合形成自噬溶酶体，继而将其内容物降解的过程。微自噬是溶酶体膜直接内陷将底物包裹并快速降解的过程。分子伴侣介导的自噬是溶酶体膜上溶酶体相关膜蛋白2A受体有选择性地降解含有五肽氨基酸序列KFERQ的蛋白质，热休克蛋白70识别并将其转入溶酶体降解的过程[9]。
2.1 哺乳动物的雷帕霉素靶(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路 mTOR是一种非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可整合细胞外信号，磷酸化下游靶蛋白核糖体，影响基因转录与蛋白质翻译，从而参与调控细胞生长、增殖等过程。mTOR的生物学功能的多样性，使其成为当今生物学研究的焦点之一。mTOR与蛋白质合成、免疫、细胞运动及代谢、细胞凋亡及自噬等均有联系[10]。
mTOR信号通路上游途径主要通过反馈饥饿、生长因子不足、缺氧和内质网应激等信号，从而抑制mTORC1诱导自噬，维持细胞体内的稳定状态；mTOR的下游途径主要是通过mTORC1和mTORC2两个亚型的蛋白复合体调节自噬。mTOR包含mTORC1和mTORC2两种不同复合体，复合体之间可以通过相互作用发出一定的自噬信号[6]。mTORC1主要由FRB、MTOR调节相关蛋白(regulatory-associated protein of mTOR，RAPTOR)、G蛋白β样蛋白(G-protein β-subunit like protein，GβL)、DEP域与DEPDC6和富脯氨酸Akt底物40组成。FRB可以与雷帕霉素受体FKBP12结合抑制mTORC1活性，诱导自噬[11]。RAPTOR与真核细胞始动因子4E结合蛋白1(4E binding protein,4EBP1)、核糖体S6蛋白激酶(S6 kinase,S6K)和Ulk1结合后可以激活4EBP1和S6K促进蛋白和核糖体合成，抑制Ulk1活性，从而抑制自噬形成；mTORC2复合体由mTOR、mTOR的雷帕霉素不敏感组分、应激激活蛋白激酶相互作用蛋白1、mTOR的雷帕霉素不敏感蛋白、GβL和DEPDC6组成，mTORC2可通过激活Akt(也称蛋白激酶B)抑制转录因子FOXO，激活PKC调节肌动蛋白骨架，激活血清和糖皮质激素诱导的激酶1增加细胞抗压性[12]。通过STZ诱导的糖尿病小鼠模型实验证实，雷帕霉素可抑制mTORC1活性诱导自噬，降低肾细胞增殖核抗原mRNA、转化生长因子β、血管内皮生长因子和单核细胞化学引诱物蛋白1表达，同时减少肾小球α-平滑肌肌动蛋白表达和肾小球系膜基质积累，从而阻止肾脏肥大保护DN进一步发生。
2.2 腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated kinase,AMPK)信号通路 AMPK是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，也是一种重要的代谢应急蛋白激酶。AMPK是由α，β，γ 3个亚基构成的异源三聚体蛋白，AMPK的活性根据AMP/ATP比值反馈信息进行相应的调节；AMPK信号通路是自噬正调节信号通路，在细胞能量不足条件下被激活。丝氨酸/苏氨酸激酶11、钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶激酶β和转化因子β激活蛋白激酶1(transforming growth factor-β-activated kinase 1，TAK1)[13]。在进行相应调节的过程中，CaMKKβ和TAK1结合可以有效细胞内钙的浓度，与肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体相互作用，激活AMPK信号通路诱导自噬[14]。AMPK也可通过TSC1/2-Rheb信号通路或Raptor相关调节蛋白磷酸化作用，抑制mTORC1活性，诱导自噬[15]。与此同时，腺苷酸活化蛋白激酶还可直接磷酸化Ulk1/2诱导自噬[16]。
STZ诱导的糖尿病大鼠模型实验发现，二甲双胍和5-氨基-4-甲酰胺咪唑核糖核苷酸相互作用之后可以增强AMPK磷酸化作用，抑制mTOR活化行为的发生，进而诱导自噬发生阻止肾脏肥大。此外，二甲双胍和白藜芦醇还可直接激活AMPK活性机制，诱导自噬，减少蛋白尿，进一步调节肾功能。与此同时，当肾脏细胞AMPK活性受到抑制之后，AMPK激活剂能够恢复AMPK的活性，从而进一步诱导自噬，主动发挥保护肾脏的作用。
2.3 沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)信号通路 SIRT1是NAD+依赖的组蛋白去乙酰化酶，NAD+/NADH比值的增加能激活SIRT1。SIRT1是细胞能量传感器，通过依赖NAD+浓度调节细胞能量变化和氧化还原反应。SIRT1直接脱掉人叉头框蛋白O3,增强BCL2/BNIP3蛋白过表达,或者SIRT1导致自噬必需因子Atg5、Atg7、LC3脱乙酰基，从而诱导自噬。其诱导自噬的机制尚未清楚。主要作用机制是涉及减少活性氧(reactive oxygen species,ROS)，增强自噬，稳定线粒体功能，从而维持细胞生存状态[17]。
在糖尿病动物模型中，SIRT1肾脏表达明显减少。白藜芦醇作为SIRT1激动剂，能通过增加SIRT1活性，诱导自噬而改善肾功能不全[18]。白藜芦醇还能减少Ⅳ型胶原和纤黏连蛋白表达，减少高糖诱导的氧化应激和系膜细胞的衰老与凋亡[19-20]，从而改善STZ诱导的糖尿病大鼠肾损伤。表明SIRT1具有肾脏保护作用。
3.1 氧化应激 氧化应激是细胞内氧自由基的产生与清除失衡，导致ROS在细胞内蓄积而引起氧化损伤的过程。DN中ROS产生主要来源于晚期加糖作用、多元醇代谢反应和蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)活化作用等。线粒体的呼吸链功能不足也会引起产成ROS[21]。ROS介导自噬的作用机制是高糖诱导细胞产成ROS，激活PERK诱导自噬，自噬可清除受损的线粒体，降低ROS对细胞的毒性，恢复细胞稳态[22]。
3.2 晚期糖基化终末产物 高糖诱导的肾损伤引起细胞内一些列新陈代谢变化，自噬受到抑制，晚期糖基化终末产物(advanced glycationend products,AGEs)在细胞内积聚，细胞内AGE与RAGE相互作用[23]，激活PKC，引起产生ROS，诱发氧化应激，使细胞内环境紊乱，DN进一步发展。自噬能够清除AGEs,改善糖尿病肾功能不全等血管并发症，如肝细胞生长因子重组糖尿病小鼠，其肝细胞生长因子激活自噬溶酶体，增强自噬清除AGEs，改善肾功能不全。
3.3 缺氧 缺氧引起的肾损伤是导致DN发展的另一种机制。在DN发病机制的研究中发现，缺氧也可诱导自噬并在DN发生发展中扮演重要角色。缺氧诱导自噬主要通过激活缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)来完成的。HIF-1α诱导Bnip3、Bnip3L过表达，将Beclin1从与Bcl-2结合中释放出来，解离的Beclin1参与自噬的形成[8]。缺氧也可通过引起线粒体受损，ROS积累，诱导自噬，自噬清除受损线粒体，减少ROS发挥保护细胞作用。
3.4 内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS) ERS是大量未折叠蛋白和错误折叠蛋白在内质网中积累而引起内质网损伤，通过内质网主要信号通路发生未折叠蛋白反应。未折叠蛋白反应主要由内质网膜上3种应激传感蛋白控制：蛋白激酶R样内质网激酶、转录因子6和肌醇依赖酶1[24]。内质网为自噬体形成提供自噬体膜的主要来源。ERS可以诱导自噬体形成，与DN发病机制密切相关[25]。PERK可通过上调转录因子4，促进LC3和Atg5转录，诱导自噬。
总之，在DN发病机制的研究中自噬的作用不容忽视，自噬受到抑制可导致ROS、AGEs等毒性物质积累，随后缺氧和内质网应激均会造成肾脏细胞的进一步损伤。增强自噬，可清除受损细胞器，维持细胞稳态。自噬对肾脏细胞可能起保护作用，具体机制目前还不是很明确。自噬成为DN治疗的新靶点还有待于进一步研究。
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(本文编辑：刘斯静)
[收稿日期]2015-11-08；[修回日期]2015-12-25
[作者简介]孔祥凤(1989-)，女，河北保定人，河北医科大学基础医学院医学硕士研究生，从事肾脏病理学和肿瘤病理学研究。
[中图分类号] R587.24
[文献标志码] A
[文章编号] 1007-3205(2016)04-0477-04
*通讯作者