·论 著·
严静霞1，郭 勇2，张 瑞1，郭 唯3，华国祥4，苏军华1*
(1.河北医科大学第二医院检验科，河北 石家庄 050000；2. 河北省石家庄市第一医院医务处，河北 石家庄 050011；3.河北省深州市医院检验科，河北 深州 053899；4.邯郸(陶瓷)集团总公司医院内科，河北 邯郸 056011)
[摘要]目的 观察白黎芦醇对人肺癌细胞A549增殖及核转录因子κB (nuclear factor-kappa B,NF-κB)表达的影响。方法选用噻唑蓝(methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromide，MTT)法检测白藜芦醇对A549细胞增殖的影响；采用逆转录PCR (reverse transcription-PCR,RT-PCR)检测白藜芦醇对A549细胞NF-κB信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA) 表达的作用；采用免疫印迹法检测白藜芦醇对肺癌A549细胞NF-κB蛋白水平的影响。结果随白藜芦醇浓度的增加，B、C、D组细胞生长抑制率均高于A组，C、D组高于B组，D组高于C组(P<0.05)。B、C、D组24、48 h细胞生长抑制率高于12 h，48 h细胞生长抑制率高于24 h(P<0.05)。经100 μmol/L白藜芦醇作用48 h后，A549细胞可以明显下调NF-κB mRNA和蛋白水平的表达。结论白藜芦醇可以明显抑制肺癌A549细胞的增殖及NF-κB的表达。
[关键词]肺肿瘤；白藜芦醇；细胞凋亡；NF-κB
doi：10.3969/j.issn.1007-3205.2016.09.018
肺癌是常见恶性肿瘤之一，其发病率及病死率均居首位[1]。近几年，由于受环境影响，我国肺癌发病率呈上升趋势且发病人群越来越年轻。虽然治疗肺癌的方法多种多样，但效果并不明显，近年来统计资料显示我国肺癌患者5年生存率不到16%[2]。故探讨肺癌的发病机制，并对癌前病变进行干预，是一项紧迫而有意义的工作[3]。中药及其提取物治疗癌症有着悠久的历史且安全低毒。白藜芦醇是天然多酚类化合物，具有广泛抗肿瘤的作用并且不良反应小，在肿瘤的发生发展中起到干扰作用，能够防止肿瘤细胞的扩散。为此，本研究观察白藜芦醇对核转录因子κB (nuclear factor-kappa B,NF-κB)的影响，旨在为开发新的抗肺癌药物提供理论基础。现报告如下。
1.1 试剂与仪器 白藜芦醇购自美国Sigma公司，人肺癌细胞株A549由河北医科大学第二医院实验室保存，RPMI1640培养基购于Gibcobrl公司，噻唑蓝(methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromide，MTT)以及二甲基亚砜(dmethyl sulfoxide, DMSO)均购自Sigma公司，兔抗人NF-κB购于上海Santa公司，山羊抗兔二抗购于上海康成公司。总RNA提取试剂盒及PCR扩增试剂盒均购自Takara 公司，逆转录试剂盒购自北京全式金生物有限公司，BCA(bicinchoninic acid)蛋白定量试剂盒购自美国Sigma公司，总蛋白提取试剂盒购自上海生物工程有限公司，Biorad凝胶成像分析系统购自江苏捷达公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养及白藜芦醇药液稀释 将人肺癌细胞株A549细胞培养于RPMI1640培养基中(含有10%新生牛血清和100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素)。在37 ℃、5%CO2饱和适度温箱中培养。待细胞生长至70%～80%融合，胰蛋白酶常规消化2 d传1代。将白藜芦醇溶于100%DMSO后虑菌，离心，取上清液制成浓度为100 μmol/L的原液，分装，置于4 ℃冰箱避光保存。以含10%胎牛血清的RPMI1640培养基稀释后使用。
1.2.2 实验分组 实验分为对照组A，实验组B、C、D，共4组。B组为加入浓度50 μmol/L的白藜芦醇后的A549细胞；C组为加入浓度100 μmol/L的白藜芦醇后的A549细胞；D组为加入浓度150 μmol/L的白藜芦醇后的A549细胞。
1.2.3 细胞的增殖测定 采用MTT法检测细胞增殖抑制率，取对数期A549细胞，胰酶消化后接种于96孔培养板中，每孔4×104个，A、B、C、D组各接种10孔，4组置于37 ℃，5%CO2培养箱内预培养24 h；4组分别加入浓度为0、50、100、150 μmol/L的白藜芦醇，经12、24、48 h处理，每孔加入MTT 20 μL，培养箱孵育4 h，加入DMSO 150 μL，振荡15 min。每组6个复孔，同时设调零组。应用酶联免疫检测仪检测590 nm吸光度值。计算增殖抑制率。
1.2.4 逆转录PCR法检测NF-κB在A549细胞中的表达 取对数期的A549细胞，经100 μmol/L白藜芦醇处理48 h后收集细胞。按照试剂盒说明书提取总RNA并逆转录合成cDNA，以cDNA为模板进行PCR扩增。NF-κB及GAPDH引物由上海生工设计。NF-κB上游引物序列为:5′-GGACACGACCTCTGACACAT-3′，下游引物序列为5′-TAGGGTGAGGGTAGTCGATCA-3′，扩增产物长度为216bp；GAPDH上游引物序列：5′-GGAAGGAGCCCTGTGGCAT-3′，下游引物序列：5′-CTACTAGGATATGGGGACG-3′，扩增产物长度为305 bp。反应条件：95 ℃ 2 min，95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30个循环，72 ℃延伸10 min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，Biorad凝胶图像采集与分析系统进行扫描分析。以NF-κB/GAPDH的平均光密度比值来表示NF-κB的mRNA水平，进行半定量分析。
1.2.5 免疫印迹法检测 取对数期生长的A549细胞，经100 μmol/L白藜芦醇处理48 h后收集细胞。按照试剂盒说明书提取总蛋白。BCA蛋白定量后调节蛋白体积浓度。配置4%浓缩胶和12%的分离胶，取各组A549细胞蛋白50 μg，与上样缓冲液混合后沸水煮5 min，冷却后加样进行电泳。转膜后5%脱脂奶粉室温封闭2 h。按1∶1 000稀释一抗，4 ℃封闭过夜。TBST洗涤3次，每次10 min。1∶1 000稀释二抗，37 ℃孵育1.5 h，洗膜3次，每次15 min。PVDF膜显色：Pierce化学发光底物A液与B液1∶1混合，室温反应5 min后，吸干反应液，应用化学发光及荧光影像分析仪进行图像分析。
1.3 统计学方法 应用SPSS 18.0软件进行统计学分析，计量资料比较分别采用单因素方差分析和SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 白藜芦醇对肺癌细胞A549的增殖抑制作用 通过MTT法观察A549的增殖情况，结果显示，随白藜芦醇浓度的增加，B、C、D组细胞生长抑制率均高于A组，C、D组高于B组，D组高于C组，差异有统计学意义(P<0.05)；A组12、24、48 h细胞生长抑制率差异无统计学意义(P>0.05)，B、C、D组24、48 h细胞生长抑制率高于12 h，48 h细胞生长抑制率高于24 h，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。
表1 白藜芦醇对A549细胞增殖的影响
Table 1 Resveratrol affect A549 cell proliferation
*P<0.05与B组比较 #P<0.05与C组比较 △P<0.05与24 h比较 ☆P<0.05与48 h比较(q检验)
2.2 逆转录PCR观察白藜芦醇对NF-κB mRNA水平的影响 逆转录PCR结果(图1)显示，经100 μmol/L白藜芦醇作用后A549细胞48 h的NF-κB mRNA光密度值为0.37±0.12，明显低于12 h的0.75±0.08和24 h的0.55±0.11，且24 h的光密度值低于12 h，差异有统计学意义(F=32.948，P=0.000)。
图1 NF-κB mRNA的表达
Figure 1 mRNA expression of NF-κB
2.3 免疫印迹法结果 将质量浓度为100 μmol/L白藜芦醇作用A549细胞，结果显示能明显抑制A549细胞中NF-κB蛋白的表达，并且在处理48 h时最明显(图2)。
图2 NF-κB蛋白的表达
Figure 2 Protein expression of NF-κB
肺癌的亚型中，非小细胞肺癌占有很大比例，约为85%，是导致肺癌患者死亡的主要因素之一[4]。晚期非小细胞肺癌可采取化学治疗、生物免疫治疗等多种方法，但疗效仍不满意，并且容易出现耐药现象，结合非小细胞肺癌早期容易出现远处转移，使应用化疗药物受到了很大限制。目前公认的肺癌根治方法是手术治疗,但大多数已确诊的肺癌患者都已经失去了最佳的手术时机；现在放疗技术被临床广泛应用于对肺癌患者的治疗，其提高了肺癌患者的生存质量并对延长患者的生存期具有积极的意义，但放疗技术对于已经发生远处转移的肺癌患者是否有效还有待观察，故无论对于已经进行手术治疗的肺癌患者还是无法进行手术的患者，采用辅助化疗仍然是最有效和广泛的治疗方式[5]。寻找治疗非小细胞肺癌的新药物对延长肺癌患者的生存期具有重要而深远的影响。
白藜芦醇是天然多酚类化合物，具有广泛的生理活性如抗感染、抗动脉粥样硬化、抗氧化并且清除自由基等多种作用。研究表明，白藜芦醇有预防肿瘤的作用，效果令人满意，并且不良反应少[6]。大量研究表明，白藜芦醇对多种肿瘤细胞均有抑制作用，如肝癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、胃癌细胞等；针对胃肠道等消化系统恶性肿瘤，白藜芦醇还能促肿瘤分化，抑制肿瘤增殖，可综合多靶位的调节肿瘤细胞的各个层次的分子,起到调节平衡的作用；白藜芦醇具有引发肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤增殖的作用[7-10]。研究表明，白藜芦醇具有抑制结肠癌细胞增殖并能促进其凋亡的作用，其机制可能与下调β-catenin mRNA的表达进而抑制Wnt/β-catenin信号通路有关[11]。李覃等[12]采用5 mg/kg剂量的白藜芦醇处理肝癌荷瘤小鼠，结果显示白藜芦醇处理组CD4、CD25T细胞数量明显降低，且Foxp3表达下调，其作用机制可能与调控STAT3磷酸化活性有关。另外，Banaganapalli等[13]发现一种新的白藜芦醇衍生物通过降低NF-κB活性诱导肿瘤细胞凋亡。采取加强环境保护、适宜饮食、适宜体育等措施，一些癌症是可以预防的。而白藜芦醇是一种纯天然的抗癌小分子化合物，具有广泛的生物学作用，其来源广泛，虎杖、葡萄中白藜芦醇的含量较高，且来源于植物提取的白藜芦醇绿色安全无污染，符合人们对绿色食物的追求。近几年越来越对的研究显示白藜芦醇具有抗多种肿瘤细胞的作用，其中就包括肺癌。对于白藜芦醇的抗癌作用机制，主要有通过诱导癌细胞周期阻滞在G1/S期进而抑制细胞增殖[14]；另外，白藜芦醇还可通过调控肿瘤相关基因的表达来影响肿瘤细胞的生长[15]。白藜芦醇的抗癌作用已得到越来越多的认可，其中白藜芦醇在肺癌的起始、形成、进展3个阶段均显示出抗癌作用。华丛书等[16]研究表明白藜芦醇抑制肺癌细胞A549的增殖并通过激活p-38MAPK信号通路诱导A549细胞的凋亡。本研究结果与其一致。白藜芦醇作为纯天然的具有抗癌效应的物质，其抗癌谱广且不良反应较少，因此在抗肿瘤或化疗增敏中具有良好的前景。
NF-κB是一种存在于真核细胞内的转录因子，具有高度保守、多项调节的特点。NF-κB在各种刺激下均能作出快速反应，调控多种基因的表达，从而参与机体的免疫应答、炎症反应、细胞增殖、分化与凋亡等生理功能，而且NF-κB的过度活化与恶性肿瘤的发生发展有着密切关系。研究表明在癌细胞的发生过程中，NF-κB的活性显著增加[17]。NF-κB是一条与调控肿瘤相关的信号通路，有可能是一种很有发展前景的抗肿瘤的靶点。本研究检测不同浓度白藜芦醇对A549细胞增殖的影响，结果显示，在浓度为100 μmol/L、150 μmol/L的白藜芦醇处理A549细胞48 h后，白藜芦醇能够明显地抑制肺癌细胞的增殖，且这种抑制作用具有时间及浓度的依赖性；采用逆转录PCR检测白藜芦醇对A549细胞NF-κB mRNA 表达的作用和免疫印迹法检测白藜芦醇对NF-κB蛋白的影响，结果显示，经100 μmol/L白藜芦醇作用后A549细胞48 h可以明显下调NF-κB的表达，NF-κB mRNA下降至总mRNA的30%，并且随着作用时间的延长，这种抑制作用更显著。提示白藜芦醇对肺癌A549细胞增殖抑制作用可能与其调节NF-κB活性有关。
综上所述，白藜芦醇对肺癌细胞A549具有明显抑制细胞增殖效应，提示白藜芦醇在肺癌治疗中通过明显下调NF-κB的表达来达到抑制肺癌细胞A549的增殖的作用，NF-κB作为白藜芦醇抗癌过程中的一个潜在作用靶点发挥重要的作用。这个结果同时表明，白藜芦醇可以成为有效抑制肺癌的化学预防治疗药物。
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(本文编辑：赵丽洁)
YAN Jing-xia1, GUO Yong2, ZHANG Rui1, GUO Wei3, HUA Guo-xiang4, SU Jun-hua1*
(1. Department of Laboratory Medicine, the Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050000,China; 2.Department of Medical, the First Hospital of Shijiazhuang City, Hebei Province,Shijiazhuang 050011,China; 3.Department of Laboratory Medicine, the Hospital of Shenzhou City, Hebei Province, Shenzhou 053899, China; 4.Department of Internal Medicine,General Hospital of Handan(Tao Ci) Group, Handan 056011, China)
[Abstract]Objective To study the effect of resveratrol on proliferation of human lung cancer cell line A549 and the expression of nuclear factor kappa B(NF-κB). Methods The effect of resveratrol on the proliferation of A549 cells was detected by methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromide(MTT) method. The effect of resveratrol on the expression of mRNA NF-κB in A549 cells was detected by reverse transcription-PCR (RT-PCR). Effect of resveratrol on NF-κB protein levels in lung cancer A549 cells was detected by western blotting. Results With the increase of the concentration of resveratrol，the cell growth inhibition rates in group B, C and D were higher than in that in group A. The cell growth inhibition rates in group C and D were higher than that in group B. The cell growth inhibition rates in group D was higher than that in group C(P<0.05). Cell growth inhibition rate at 24 h and 48 in group B, C and D are higher than that at 12 h. Cell growth inhibition rate at 48 h was higher than that at 24 h(P<0.05). A549 cells with 100 mol/L resveratrol for 48 h can significantly down regulate the expression of NF-kappa mRNA. Conclusion Resveratrol can significantly inhibit the proliferation of lung cancer
[Key words]lung neoplasms; resveratrol; apoptosis; NF-kappa B
[收稿日期]2016-03-31；
[修回日期]2016-05-05
[基金项目]河北省科学技术研究与发展指导计划(152777123)
[作者简介]严静霞(1976-)，女，河北石家庄人，河北医科大学
*通讯作者
[中图分类号]R734.2
[文献标志码]A
[文章编号]1007-3205(2016)09-1064-05
第二医院主管检验师，医学学士，从事临床检验学研究。
A549 cells and the expression of NF-κB.