·论 著·
[摘要] 目的观察地塞米松(dexamethasone,DEX)对异丙肾上腺素(isoprotereno，ISO)致小鼠急性心肌缺血损伤的影响并探讨其作用机制。方法将16只昆明种小鼠随机分成正常对照(control,CON)组4只、ISO组4只、地塞米松预处理(dexamethasone pretreatment,DEX-pre)组4只、DEX组4只。CON组、ISO组首次处理前30 min给予等量0.9%氯化钠注射液腹腔注射预处理。CON组给予等量0.9%氯化钠注射液腹腔注射处理。ISO组给予5 mg/kg ISO，每日腹腔注射1次，连续3 d。DEX-pre组在首次ISO注射前30 min给予DEX 1.25 mg/kg腹腔注射，余同ISO组。DEX组在第2天、第3天ISO注射30 min后给予DEX 1.25 mg/kg腹腔注射，余同ISO组。在HE染色光镜下观察心肌组织的病理学改变；酶联免疫吸附测定法检测血清肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)的变化；流式细胞分析检测脾脏T细胞亚群(杀伤性T细胞即CD4+T细胞、 抑制性T细胞即CD8+T细胞、激活的杀伤性T细胞即CD4+CD69+T细胞、激活的抑制性T细胞即CD8+CD69+T细胞)变化。结果①与ISO组比较，DEX-pre组心肌损伤得到明显改善(P<0.05)，DEX组无明显变化(P>0.05)。②DEX组TNF-α含量明显高于CON组、ISO组和DEX-pre组，差异有统计学意义(P<0.05)。③DEX-pre组CD4+T细胞、CD4+CD69+T细胞、CD8+CD69+T细胞与其他3组差异有统计学意义(P<0.05)，其他3组之间差异无统计学意义(P>0.05)；DEX-pre组CD8+T细胞低于其他3组，DEX组低于CON组与ISO组，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论DEX预处理对ISO致小鼠急性心肌缺血损伤的心肌具有明显保护作用，而损伤后给予DEX治疗则无保护作用。可能机制与DEX预处理导致免疫功能改变及炎性细胞因子改变相关，确切机制有待进一步研究。
[关键词] 心肌缺血；地塞米松；异丙肾上腺素 doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.10.011
目前认为地塞米松(dexamethasone,DEX)可以通过炎症信号通路削弱实质性脏器缺血-再灌注损伤，这为临床预防急性损伤提供了新的选择和理论支持。进一步研究提示削弱炎症反应可减轻急性心肌缺血损伤，且证实DEX等药物预处理对心脏缺血-再灌注损伤、肾脏缺血-再灌注损伤等有诱导早期保护和延迟保护作用[1-2]。本研究观察地塞米松预处理或治疗对异丙肾上腺素(isoprotereno，ISO)致小鼠急性心肌缺血损伤影响，旨在探讨临床应用的可行性。
1.1 实验动物、主要试剂及仪器 昆明种小鼠：雄性，体质量20～22 g，浙江大学实验动物中心提供，实验动物合格证号2007000580817，许可证号SCXK(沪)2012-0002。盐酸异丙肾上腺素注射液：上海禾丰制药有限公司，产品批号131003。地塞米松磷酸钠注射液：湖北天药药业股份有限公司，产品批号1408231。流式细胞仪：美国Becton Dickinso公司。Anti-CD4 FITC antibody：美国Ebioscience公司，克隆号RM4-4，货号11-0043-85，批号E00087-1632。Anti-CD8a APC antibody：美国Ebioscience公司，克隆号53-6.7，货号100711，批号B177121。Anti-CD69 PE antibody：美国Ebioscience公司，克隆号H1.2F3，货号12-0691-83，批号B177121。肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)ELISA试剂盒：美国Ebioscience公司，货号BMS607HS。
1.2 动物模型制备与分组 采用腹腔注射ISO建立小鼠急性心肌缺血模型。将16只小鼠随机分为正常对照(control,CON)组、ISO组、地塞米松预处理(dexamethasone pretreatment,DEX-pre)组、地塞米松治疗(dexamethasone treatment,DEX)组各4只。CON组、ISO组首次处理前30 min给予等量0.9%氯化钠注射液腹腔注射预处理。CON组给予等量0.9%氯化钠注射液腹腔注射处理。ISO组给予5 mg/kg ISO，腹腔注射1次/d，连续3 d。DEX-pre组在首次ISO注射前30 min给予DEX 1.25 mg/kg腹腔注射，余同ISO组。DEX组在第2天、第3天ISO注射30 min后给予DEX 1.25 mg/kg腹腔注射，余同ISO组。第4天各组小鼠用10 g/L戊巴比妥钠(50 g/kg)麻醉，在超净台中进行心脏取血后取全心室，并取脾脏。全血以3 500 r/min离心15 min，分离取血清，转置于-20 ℃低温冰箱保存待测。
1.3 心脏组织HE染色 取心脏后以4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋整个心脏，间断连续切片，切片厚约5 μm，常规HE染色，光镜下观察各组心肌病理改变。形态学计分标准[3]：0级，心肌细胞排列紧密，横纹清晰，心肌纤维染色均匀，核居中，间质未见血管扩张及炎细胞浸润，组织间隙无水肿，无出血坏死，心外膜、心内膜无异常计0分；Ⅰ级，心肌细胞排列稀疏，间质血管扩张及少量炎细胞浸润，肌浆分布不匀，心肌间质水肿，无出血，可见心肌散在的点状坏死，主要为凝固性坏死灶，局限在心内膜下，计2分；Ⅱ级，部分心肌坏死灶呈片状分布，灶间无连接，病变累及心壁全层，间质可见血管扩张及炎细胞浸润，有灶性出血，心肌间质有炎性出血及心肌间质水肿，计4分；Ⅲ级，心肌广泛性大片坏死，灶间相互连接累及心壁全层，有明显的间质血管扩张、水肿、出血及炎细胞浸润，计6分。
1.4 ELISA检测TNF-α 取低温冰箱保存血清双抗体夹心ELISA法检测血清中炎性细胞因子TNF-α的含量变化。
1.5 流式细胞分析 剥除小鼠脾脏表面结缔组织被膜后在200目不锈钢网中轻轻研磨，PBS液洗涤2次后加Tris-NH4Cl液裂解红细胞，再洗涤并调整细胞浓度为1×106/100 μL。取上述各组织单个核细胞悬液100 μL 加入CD4、CD8、CD69荧光抗体，常规设置平行空白对照，4 ℃避光孵育30 min,PBS洗3遍后，用流式细胞仪进行检测，检测小鼠脾脏单个核细胞的T细胞亚群(杀伤性T细胞即CD4+T细胞、 抑制性T细胞即CD8+T细胞、激活的杀伤性T细胞即CD4+CD69+T细胞、激活的抑制性T细胞即CD8+CD69+T细胞)在ISO致心肌缺血损伤及使用DEX后的变化情况。
1.6 统计学方法 应用SPSS 16.0软件进行数据分析。计量资料比较分别采用单因素方差分析和SNK-q检验；等级资料比较采用秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 各组心肌组织病理学改变 HE染色显示：CON组心肌细胞排列整齐、致密，胞质着色均匀，胞核清晰，间质细胞无增生，未见炎性渗出，无水肿(图1A、E)；ISO组心肌细胞体积增大呈圆形或类圆形，排列紊乱，细胞核固缩深染，血管和心肌细胞之间可见纤维增多、炎性细胞浸润、少许淋巴细胞浸润，少量红细胞外渗，多处见局灶性坏死(肌溶解、核消失或不着色)(图1B、F)。DEX-pre组心肌损害较ISO组明显减轻，可见残存正常肌纤维明显增多(核圆形、有核仁，胞浆深红色)，局灶性坏死明显减少散在的点状，肌纤维排列紊乱改善，血管和心肌细胞之间未见纤维增多、炎性细胞浸润、淋巴细胞浸润(图1C、G)；DEX组肌纤维间充血水肿明显，可见残存少许正常肌纤维，多处见肌溶解、核消失或不着色的局灶性坏死，炎性细胞浸润不明显(图1D、H)。
各组损伤程度差异有统计学意义(P<0.05)，两两比较结果显示 ISO组、DEX组与CON组差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。
图1 光镜下心肌组织形态结构
A.CON组(HE ×200);B.ISO组(HE ×200);C.DEX-pre组(HE ×200);D.DEX组(HE ×200);E.CON组(HE ×400);F.ISO组(HE ×400);G.DEX-pre组(HE ×400);H.DEX组(HE ×400)
Figure 1 The structure of myocardial tissue
表1 各组心肌病理损伤程度比较
Table 1 The degree of myocardial injury 
，例数)
组别 0级Ⅰ级Ⅱ级Ⅲ级CON组4000 ISO组0040*DEX-pre组0400 DEX组0130* Hc13.636 P0.003
*P<0.05与CON组比较(秩和检验)
2.2 各组血清TNF-α含量比较 DEX组TNF-α含量明显高于CON组、ISO组和DEX-pre组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。
2.3 各组脾脏T细胞亚群变化 DEX-pre组CD4+T细胞、CD4+CD69+T细胞、CD8+CD69+T细胞与其他3组差异有统计学意义(P<0.05),其他3组之间差异无统计学意义(P>0.05)。DEX-pre组CD8+T细胞低于其他3组，DEX组低于CON组和ISO组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。
表2 各组血清TNF-α含量比较
Table 2 The expression of TNF-α in serum in each group
组别 TNF-α含量CON组1.58±0.21*ISO组2.35±0.42*DEX-pre组0.42±0.09*DEX组18.73±2.80 F148.993 P0.000
*P<0.05与DEX组比较(SNK-q检验)
表3 各组脾脏CD4+、CD8+、CD69+T细胞表达比较
Table 3 The expression of CD4+,CD8+,CD4+CD69+,CD8+CD69+ in T cells in spleen
组别 CD4+T细胞CD8+T细胞CD4+CD69+T细胞CD8+CD69+T细胞CON组18.50±0.70*#9.66±0.37*#12.10±0.65*6.44±0.32*ISO组15.50±0.90*13.20±0.50*#18.00±0.68*5.89±0.31*DEX-pre组3.90±0.213.55±0.1438.80±1.967.79±0.56DEX组16.00±1.20*9.01±0.36*15.80±1.43*5.37±0.30* F320.215811.337406.10112.016 P0.0000.0000.0000.000
*P<0.05与DEX-pre组比较 #P<0.05与DEX组比较(SNK-q检验)
采用腹腔注射ISO是建立小鼠急性心肌缺血的常用模型。连续注射ISO使心肌中氧化应激剧增，导致氧自由基聚集，可使生物膜磷脂在结构与功能方面发生异常变化，细胞膜通透性增高，肌浆内的可溶性酶大量释放进入血液中，使血清心肌酶水平显著升高，导致心肌缺血损害[3-4]。糖皮质激素通过调节细胞生长、发育、自身稳定和细胞凋亡来维持机体组织细胞的平衡及其功能， 而且糖皮质激素具有抗炎等作用。以往研究表明DEX预处理可使缺血-再灌注后心肌损伤程度明显减轻，减少炎症因子单核细胞趋化因子1、TNF-α的表达，使炎症控制在一定的水平[5]。本研究探索DEX预处理及治疗对急性心肌缺氧损伤效应，并研究细胞因子TNF-α及T细胞亚群变化(CD4+、CD8+、CD69+)发挥的作用，旨在为DEX在不稳定性冠心病，尤其是急性心肌梗死超早期临床应用提供依据。本研究ISO损伤后心肌局灶性坏死明显，给予DEX预处理心肌损害明显减轻，给予DEX治疗心肌损害无明显改变，证实DEX预处理对ISO致小鼠急性心肌缺血损伤的心肌具有明显保护作用，而损伤后给予DEX治疗则无保护作用。
TNF-α不仅是有效的肿瘤杀伤因子，还是重要的前炎性细胞因子和免疫调节因子，在介导炎症反应中有很重要的作用。在心肌受损和超负荷时，心肌细胞和成纤维细胞中TNF-α等炎症调节因子表达上调[6]；临床观察研究提示冠心病患者血清TNF-α水平明显高于正常人，而且随病情的加重而升高，且TNF-α在急性心肌梗死发病早期即可明显升高，检测TNF-α对急性心肌梗死早期诊断具有重要意义[7-9];另外， TNF-α水平的升高与心肌功能抑制有明显的相关性[10]，而在阿托伐他汀治疗急性脑梗死中升高的TNF-α下降更为明显[11]。本研究显示ISO损伤后TNF-α明显升高与上述一致，说明血清TNF-α与急性心肌缺氧损伤有一定相关性。进一步血清TNF-α含量检测显示经DEX预处理，ISO导致TNF-α有下降，与以往DEX对小鼠心肌缺血-再灌注损伤、肾缺血-再灌注损伤、脑出血大鼠脑水肿引起TNF-α水平改变的报道相符[12]；且经DEX预处理TNF-α低于CON,可能DEX预处理在ISO导致心肌损伤中抑制TNF-α等炎性细胞因子作用比心肌缺血-再灌注损伤更明显，其更有实用性。在ISO导致损伤后给予DEX治疗TNF-α反之明显升高，说明DEX治疗无明显得益。因此，认为DEX预处理对ISO所致小鼠心肌缺血明显的保护作用中TNF-α水平的改变发挥重要的作用。可能的机制：TNF-α是强有力的促炎症细胞因子，降低炎症暴发，使炎症控制在一定的水平，可减轻心肌缺血损伤；DEX预处理还可有抗凋亡等作用，减轻心肌缺血损伤。 在急性心肌缺血缺氧损伤中，DEX预处理可诱导早期保护和延迟保护作用， 尤其后者保护时间长而更具潜在的实用价值，较长时间处于一种预处理的保护状态，为其临床应用的意义。
CD4+T细胞和CD8+T细胞都是炎性T细胞，通过分泌细胞因子来调节机体免疫功能，起到诱导和辅助细胞及体液免疫的作用。CD69是T淋巴细胞激活后最早表达的表面抗原，已有大量研究表明，CD69的表达可以抑制机体炎症反应，具有调节机体免疫平衡的功能。CD69可作为细胞的活化标记物,当其表达后，可作为共刺激信号促进细胞进一步活化和增殖，且CD69的表达与细胞的凋亡密切相关[13]。研究表明，CD69分子在急性脑梗死发生的早期(72 h之内)表达显著增高，且在发病的第7天仍然高表达，活化的T细胞以多种形式损伤血脑屏障，参与疾病的发展过程[14]；通过应用外源性生物反应调节剂调节机体内T细胞亚群CD3、CD4、CD8的表达水平可以辅助免疫治疗[15]；心肌组织中存在肌源性干细胞，且功能受损的心肌应用成肌细胞等肌源性细胞移植到心脏可生成大量心肌细胞，并促进周围血管、神经再生，几乎不触发受植区的免疫反应[16]。均提示免疫调节在心肌损伤中发挥一定作用。本研究结果显示DEX-pre组CD4+T细胞、CD8+T细胞明显下降，并CD4+CD69+T细胞、CD8+CD69+T细胞明显增高，病理示炎性细胞浸润减少，说明经DEX预处理后，免疫功能明显被双重抑制，可能对损伤心肌细胞起到重要保护作用。DEX组CD8+T细胞有所下降， 而CD4+T细胞、CD8+CD69+T细胞、CD8+CD69+T细胞无明显改变，没有出现相似保护作用。证实CD4+T细胞、CD8+T细胞和早期激活的T细胞(CD4+CD69+T细胞、CD8+CD69+T细胞)可能共同参ISO对心肌细胞损伤过程，CD4+T细胞、CD4+CD69+T细胞作用更为重要。DEX预处理对ISO损伤心肌保护作用可能与 CD4+T细胞、CD8+T细胞双重抑制，以及TNF-α等炎性细胞因子明显抑制协同作用密切有关；而DEX治疗不产生CD4+T细胞和CD8+T细胞双重均衡抑制， TNF-α等炎性细胞因子反而明显增高，所以也就不产生这种保护作用。因此，推断DEX预处理对免疫功能与炎性细胞因子的改变是其对心肌缺血缺氧保护作用的重要机制之一。
综上所述，在ISO所致急性心肌细胞缺血损伤中，DEX预处理可以明显改善心肌损伤,而给予DEX治疗则没有这种保护作用，其相关机制可能与DEX预处理导致T细胞亚群介导免疫应答功能改变和TNF-α等细胞因子的变化有关，这为DEX预处理治疗方法在不稳定性冠心病，尤其是急性心肌梗死超早期中的应用提供了依据。其确切机制有待进一步研究。
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(本文编辑：刘斯静)
[Abstract] Objective To investigate the potential protective effect of glucocorticoid receptor agonist dexamethasone on isoproterenol(ISO)-induced myocardial injury and the possible mechanism. Methods The sixteen mice were randomly divided into control(CON) group(n=4)， ISO group(n=4), dexamethasone pretreatment(DEX-pre) group(n=4) and dexamethasone treatment(DEX) group(n=4). The mice in CON group and ISO group were given the same amount of 0.9% sodium chloride and DEX-pre group given dexamethasone(1.25 mg/kg) injection by intraperitoneal injection as a pretreatment at 30 minutes before treatment. CON group was given the same amount of 0.9% sodium chloride injection by intraperitoneal injection; ISO group, DEX-pre group and DEX group received 5 mg/kg isoproterenol hydrochloride, daily intraperitoneal injection of 1time, for 3 consecutive days. At the second and third day, dexamethasone(1.25 mg/kg) was given after ISO injected for 30 minutes in DEX group. Myocardial tissue injury was assessed by HE staining. Flow cytometry was adopted to detect the expression of CD4+T， CD8+T， CD4+CD69+T， CD8+CD69+T cells in spleen. Results ①Compared with ISO group， the degree of myocardial injury were greatly improved(P<0.05); the degree of myocardial injury wasn't significantly difference in DEX group(P>0.05). ②The expression of TNF-α in serum in DEX group was significantly difference to the other group(P<0.05). ③The expression 0f CD4+T， CD4+CD69+T， CD8+CD69+T cells in DEX-pre group was significantly difference to the other group(P<0.05). The expression of CD8+T cells in DEX-pre group was significantly reduced to the other group(P<0.05). The expression of CD8+T cells in DEX group was significantly reduced to the control group and ISO group(P<0.05). Conclusion DEX pretreatment has protective effect against ISO-induced myocardial injury. But dexamethasone treatment don't have protective effect after injury. The mechanism might be the related with the changes of immune function and changes of inflammatory cytokines. The exact mechanism remains to be further studied.
[Key words] myocardial ischemia; dexamethasone; isoproterenol
[收稿日期] 2015-08-07；
[修回日期]2015-12-01
[中图分类号] R452.2
[文献标志码]A
[文章编号]1007-3205(2016)10-1157-05
南京军区杭州疗养院主任医师，从事老年心血管疾病诊治及疗养保
健研究。