表1 PrxⅢ和GAPDH引物序列
Table 1 The primers of PrxⅢ and GAPDH
指标 引物序列PrxⅢ(NM_022540) 上游引物:5'TCAACACGCCAAGAAAGA3' 下游引物:5'GCCATCAAGAAGTCCCTA3' GAPDH(NM_017008)上游引物:5'GCTGAGTATGTCGTGGAGT3'下游引物:5'TCTTCTGAGTGGCAGTGAT3'
[摘要] 目的观察过氧化酶Ⅲ(peroxiredoxin Ⅲ，PrxⅢ)在大鼠肾缺血再灌注损伤(renal ischemia reperfusion injury,RIRI)模型心肌内的表达变化，探讨PrxⅢ在抗氧化应激反应中的作用。方法大鼠切除右肾后，无损伤动脉夹夹闭左肾动脉，建立肾缺血再灌注损伤模型。再灌注24 h后取材(血、肾、心)。采用酶偶联速率法和苦味酸法检测血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(seaum creatinine,SCr)浓度；HE染色法观察大鼠肾组织形态；硫代巴比妥酸比色法(thiobarbituric acid,TBA)检测心肌丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量；应用逆转录聚合酶链反应法和免疫印迹法测定大鼠心肌组织内抗氧化酶PrxⅢ的mRNA与蛋白表达水平。结果RIRI组大鼠血清中BUN和SCr浓度明显高于对照组，RIRI组大鼠心肌组织中MDA含量、PrxⅢ mRNA水平相对表达量、PrxⅢ蛋白水平相对表达量明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论RIRI后，心肌组织出现过氧化损伤；PrxⅢ在肾缺血再灌注损伤大鼠的心组织内发挥了抗氧化应激的作用。
[关键词] 再灌注损伤；肾;过氧化酶Ⅲ；大鼠 doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.10.013
肾缺血再灌注损伤(renal ischemia reperfusion injury,RIRI)是泌尿外科临床治疗过程中经常发生的病理生理过程，也是导致患者术后发生急性肾衰竭和肾功能恢复延迟的重要因素[1-4]。当肾脏发生急性缺血再灌注时，会产生大量的活性氧(reactive oxygen species,ROS)，导致其处于高度的氧化应激状态，这也是缺血后再灌注时发生损伤的重要机制之一[5-7]。羟自由基(OH-)、超氧阴离子(O2-)和过氧化氢(H2O2)都是ROS的重要成员，它们可以破坏细胞内的蛋白质、脂类和DNA等生物大分子，从而影响细胞的功能，导致细胞的损伤甚至死亡[8-10]。研究发现，当肾功能受损时，其远端或邻近器官如肝、肺、心、脑和肠等的功能也会同时受损[11]。过氧化酶Ⅲ(peroxiredoxin Ⅲ, PrxⅢ)属能清除ROS的过氧化物酶系[12]，也是整个家族中唯一特异性定位于线粒体内的成员。线粒体是内源性ROS的主要产生来源，同时它自身也遭受ROS的攻击。已有研究发现，细胞线粒体内H2O2的清除与PrxⅢ具有密切关系[13-14]。心是机体内需氧量大、容易受到ROS攻击、遭受过氧化损伤的器官。在RIRI时，肾脏处于高度氧化应激状态；心脏是否也会发生过氧化损伤，心肌组织PrxⅢ的表达如何变化，尚未见相关报道。本研究观察大鼠RIRI模型心肌内的PrxⅢ表达变化，旨在探讨PrxⅢ在抗氧化应激反应中的作用，现报告如下。
1.1 RIRI模型建立及样品处理 选用健康成年雄性Wistar大鼠12只，体质量190～210 g，随机分为RIRI组和对照组各6只。6%水合氯醛(5 mL/kg)腹腔注射麻醉下，将大鼠固定于手术台上，常规备皮、消毒、铺单。自剑突向下做腹部正中切口4 cm，结扎右侧肾蒂后切除右肾。RIRI组大鼠分离左肾动脉,用无创动脉夹将其夹闭, 观察左肾颜色，由鲜红渐变为暗红，显示夹闭成功。45 min后松开动脉夹,恢复血供,可见左肾动脉充盈, 颜色迅速转为鲜红色,显示再灌注成功。对照组大鼠只分离左肾动脉并不夹闭。术后单笼饲养，自由饮食饮水。
术后24 h再次麻醉大鼠，自颈总动脉取血约5 mL，3 000 r/min离心10 min，分离血清去除红细胞，用于血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(seaum creatinine, SCr)浓度测定；取肾并用4%多聚甲醛浸泡固定，组织切片HE染色光镜观察其形态学变化；取心肌组织置于液氮中，用于丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量和PrxⅢ mRNA及蛋白水平测定。
1.2 主要试剂 Trizol、Taq DNA聚合酶等均为Invitrogen公司产品；溴化乙啶、琼脂糖、RT试剂盒为Promega公司产品；PrxⅢ一抗(兔抗鼠)Abcam公司，二抗(羊抗兔)Zymed公司。血清SCr和BUN测定试剂盒，均为中生北控生物科技股份有限公司产品；MDA测定试剂盒为南京建成科技有限公司产品。
1.3 血清SCr和BUN浓度测定 根据试剂盒说明书，采用苦味酸法测定血清样本SCr浓度，酶偶联速率法测定BUN浓度。将R1和 R2按照1∶1的比例混合成工作液，校准品开瓶即可使用，用于测定SCr浓度；用R2溶解R1，溶解后即为工作液，校准品为厂家提供，用于测定BUN浓度。各取3只直径为1 cm的比色管，分别作为空白管、校准管和样本管。在空白管内加入1 mL工作液和0.1 mL生理盐水，在校准管内加入1 mL工作液和0.1 mL校准品，在样本管内加入1 mL工作液和0.1 mL血清样本，分别混匀待检测。测定其在波长505 nm(SCr)和340 nm(BUN)、温度37 ℃条件下的吸光度值。混匀后30 s所测吸光度值为A1，再过20～60 s所测吸光度值为A2，用2次吸光度的差值，以空白管调零，计算吸光度变化值，即△A样本和△A校准。根据公式C样本=△A样本×C校准/△A校准，计算每个血清样本的SCr和BUN浓度。
1.4 肾组织形态学观察 采用HE染色法观察大鼠肾组织的形态结构。取肾组织，按常规组织切片制作步骤进行操作：脱水、透明、浸蜡、包埋，切片厚约5 μm，HE染色后封片，用奥林巴斯光学显微镜，观察肾组织的形态变化并拍摄照片。
1.5 心肌组织中MDA含量的测定 将心肌组织按照20 mg/100 μL的标准加入预冷的匀浆缓冲液(1 mmol/L盐酸苯甲脒，pH 7.4，0.1%吐温-20，50 mmol/L磷酸钾缓冲液，5 mmol/L β-巯基乙醇,1 mmol/L苯甲基磺酰氟，1 mmol/L 乙二胺四乙酸三钠盐，0.5 mol/L NaCl)，在冰浴中匀浆，条件为：4 ℃、4 000 r/min(约3 500 g)，离心20 min，取上清制成含10%心肌组织的匀浆液，按照试剂盒操作说明，采用硫代巴比妥酸比色法(thiobarbituric acid,TBA)测定心肌MDA含量。
1.6 心肌组织PrxⅢ mRNA水平相对表达量的测定 采用Trizol(Invitrogen公司)法提取心组织总RNA。用3 μg RNA反转录生成cDNA，GAPDH作为内参照，进行逆转录聚合酶链反应。用PrxⅢ与内参的扩增产物灰度值之比，表示PrxⅢ mRNA相对表达量。所用PrxⅢ、GAPDH引物序列见表1。
表1 PrxⅢ和GAPDH引物序列
Table 1 The primers of PrxⅢ and GAPDH
指标 引物序列PrxⅢ(NM_022540) 上游引物:5'TCAACACGCCAAGAAAGA3' 下游引物:5'GCCATCAAGAAGTCCCTA3' GAPDH(NM_017008)上游引物:5'GCTGAGTATGTCGTGGAGT3'下游引物:5'TCTTCTGAGTGGCAGTGAT3'
1.7 心肌组织PrxⅢ 蛋白水平相对表达量的测定 采用免疫印迹分析法，测定大鼠心肌组织内PrxⅢ蛋白的相对表达量。将心肌组织制成匀浆后，离心取上清。采用改良Lowry法测定心肌组织蛋白总量。电泳时上样量为62 μg。经电泳、转膜、封闭后，在聚偏氟乙稀(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上滴加一抗，室温(18～24 ℃)过夜，漂洗后加HRP标记的二抗。按照发光试剂的操作说明进行显影、定影、晾干。影像扫描后进行数据分析(以条带吸光度值与内参之比表示相对表达量)。
1.8 统计学方法 应用SPSS 14.0统计学软件分析数据，计量资料以
±s表示，组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 大鼠肾组织形态学改变 光镜观察结果显示：对照组大鼠肾小囊、肾血管球、集合管、远曲小管及近曲小管形态结构清晰规整；RIRI组大鼠肾小管管腔扩张明显，肾小囊囊腔扩张，部分肾小球萎缩、体积变小，肾小管间隙扩大，肾间质水肿，集合管管腔扩张等改变(图1)。
图1 大鼠肾小球、肾小管形态结构(HE ×400)
A.对照组;B.RIRI组
Figure 1 Morphology of glomeruli and tubules(HE ×400)
2.2 2组观察指标比较 RIRI组大鼠血清BUN和SCr浓度明显高于对照组，RIRI组大鼠心肌组织中MDA含量、PrxⅢmRNA水平相对表达量、PrxⅢ蛋白水平相对表达量明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2和图 2，3。
表2 2组观察指标比较
Table 2 Comparison of 2 groups of observation indicators
组别尿素氮(mmol/L)肌酐(μmol/L)MDA(mmol/g)PrxⅢmRNAPrxⅢ蛋白对照组4.462±0.541103.444±8.46510.18±1.770.95±0.170.58±0.09RIRI组13.685±4.397131.153±17.81414.01±2.291.34±0.181.01±0.17t5.0933.4593.2403.8985.367P0.0000.0060.0090.0030.000
图2 心肌组织PrxⅢ mRNA相对表达量
Figure 1 The mRNA expression of PrxⅢ in heart
图3 心肌组织PrxⅢ蛋白相对表达量
Figure 2 The protein expression of PrxⅢ in heart
肾是机体内重要的排泄和分泌器官，对于维持机体内环境的相对稳定具有重要意义。当肾功能受损时，机体其他主要脏器肝、肺、心、脑、肠等的功能也会同时受损，但机制尚不十分清楚。RIRI是临床治疗过程中一种常见的病理生理反应，多见于肾挤压伤、肾移植、部分肾切除及失血性休克等的临床治疗过程中。RIRI也是导致患者出现术后并发症如急性肾衰竭、肾移植失败的重要原因之一[1-5]。已有研究证实，氧化应激是导致RIRI的重要机制之一[5-7]。本研究的目的是观察RIRI后心肌组织内MDA含量和PrxⅢ表达水平的改变。探讨RIRI后心肌组织损伤的可能原因以及抗氧化酶PrxⅢ在此过程中的抗氧化作用，为防治RIRI所诱发的心肌组织损伤提供数据参考和理论依据。本研究首先建立大鼠RIRI的模型：第一步切除大鼠右肾，第二步分离大鼠左肾动脉，然后用无损伤动脉夹夹闭，第三步夹闭45 min后去掉动脉夹，恢复大鼠左肾的血液供应，制造大鼠RIRI模型；左肾恢复血液供应24 h后取材，左肾组织光镜观察显示RIRI组大鼠的肾小球以及肾小管均已发生明显的形态学改变。临床上常用的检测肾功能的指标是SCr和BUN。当肾功能受损时肾小球滤过率会降低，血清内BUN和SCr的浓度也会随之升高。本研究结果显示RIRI组大鼠血清BUN和SCr浓度明显高于对照组。表明RIRI组大鼠的肾功能已经受损，大鼠RIRI模型是成功的。
大鼠RIRI后，心肌组织是否发生过氧化损伤？通过检测心肌组织内MDA的含量，用MDA的含量反映心肌组织是否遭受过氧化损伤。MDA 是ROS与组织脂类物质(细胞膜等)发生过氧化反应所形成的，是最重要的脂类物质过氧化产物之一，其含量反映了组织内脂质过氧化的强度和速度，常被作为评价细胞或组织发生过氧化损伤后损伤程度的客观指标[15]。本研究结果显示RIRI组心肌组织内MDA含量明显高于对照组。推测在RIRI发生后，大鼠心肌组织遭受ROS的攻击，并与心肌组织的脂类物质发生过氧化反应，导致脂类过氧化产物的大量堆积。表明当RIRI发生后心肌组织也遭受过氧化损伤。
PrxⅢ在心肌细胞的线粒体内大量表达。已有研究证实，PrxⅢ能清除心肌细胞线粒体内产生的大量ROS，保护心肌组织免受过氧化损伤[13-14]。本研究结果显示RIRI组大鼠心肌组织内PrxⅢ的mRNA水平和蛋白水平明显高于对照组。考虑心肌组织内MDA的含量升高，再结合PrxⅢ的mRNA和蛋白水平的升高，推测当RIRI发生后，不仅肾脏内有大量ROS，而且心肌组织内的ROS含量也随之增多。过多的ROS与脂质发生过氧化反应，导致MDA等过氧化产物的大量堆积。为了清除过多的ROS，机体通过上调PrxⅢ的含量清除过多的ROS，以保护心肌组织免遭过氧化损伤。
综上所述，在RIRI时，心肌组织也发生过氧化损伤，抗氧化酶PrxⅢ可能在清除ROS、减轻心肌组织的氧化应激中发挥重要作用。这为防治RIRI所诱发的心肌损伤提供了一条新思路。
[参考文献]
[1] 孟彦丽，王切，王素玲，等.PrxⅤ和CAT在大鼠肾缺血再灌注损伤模型的表达变化[J].河北医科大学学报，2013,34(5)：508-511.
[2] Ye Q,Zhu YI,Ye S,et al. Gypenoside attenuates renal ischemia/reperfusion injury in mice by inhibition of ERK signaling[J]. Exp Ther Med,2016,11(4):1499-1505.
[3] Zhou M,Tang W,Fu Y,et al.Progranulin protects against renal ischemia/reper-fusion injury in mice[J]. Kidney Int,2015,87(5):918-929.
[4] Menke J,Sollinger D,Schamberger B,et al. The effect of ischemia/reperfusion on the kidney graft[J]. Curr Opin Organ Transplant,2014,19(4):395-400.
[5] Aksu U,Ergin B,Bezemer R,et al. Scavenging reactive oxygen species using tempol in the acute phase of renal ischemia reperfusion and its effects on kidney oxygenation and nitric oxide levels[J]. Intensive Care Med Exp,2015,3(1):57.
[6] Lee D,Park S,Bae S,et al. Hydrogen peroxide-activatable antioxidant prodrug as a targeted therapeutic agent for ischemia reperfusion injury [J]. Sci Rep,2015,5:16592.
[7] Malek M,Nematbakhsh M. Renal ischemia/reperfusion injury; from pathophysiology to treatment [J]. J Renal Inj Prev,2015,4(2):20-27.
[8] Lee D,Bae S,Hong D,et al. H2O2 responsive molecularly engineered polymer nanoparticles as ischemia/reperfusion-targeted nanotherapeutic agents [J]. Sci Rep，2013,3:2233.
[9] Lagan
AS,Sofo V,Salmeri FM,et al. Oxidative stress during ovarian torsion in pediatric and adolescent patients: changing the perspective of the disease [J]. Int J Fertil Steril,2016,9(4):416-423.
[10] Wang L,Duan Q,Wang T,et al. Mitochondrial respiratory chain inhibitors involved in ROS production induced by acute high concentrations of iodide and the effects of SOD as a protective factor[J]. Oxid Med Cell Longev，2015,2015: 217670.
[11] Fatemikia H,Ketabchi F,Karimi Z,et al. Distant effects of unilateral renal ischemia/reperfusion on contralateral kidney but not lung in rats: the roles of ROS and iNOS[J]. Can J Physiol Pharmacol，2015,94(5):477-487.
[12] Peroja P,Haapasaari KM,Mannisto S,et al. Total peroxiredoxin expression is associated with survival in patients with follicular lymphoma [J]. Virchows Arch，2016,468(5):623-630.
[13] Toledano MB,Delaunay-Moisan A. Keeping oxidative metabolism on time:mitochondria as an autonomous redox pacemaker animated by H2O2 and peroxiredoxin[J]. Mol Cell,2015,59(4):517-519.
[14] Kil IS,Ryu KW,Lee SK,et al. Circadian oscillation of sulfiredoxin in the mitochondria[J]. Mol Cell，2015,59(4):651-663.
[15] 牛林红，董会台，杨丽莉,等.不同粒径纳米二氧化钛对小鼠抗氧化能力的损伤作用[J].河北医科大学学报，2015,36(2)：184-187.
(本文编辑：赵丽洁)
[Abstract] Objective To observe the expression of peroxiredoxin Ⅲ(PrxⅢ) in renal ischemia reperfusion injury model rats and study the role in oxidative stress response. Methods After removal of the right kidney, the left renal artery without injury was removed, and the model of renal ischemia and reperfusion injury was established. After 24 hours of reperfusion, the blood and kidney were taken. The serum blood urea nitrogen(BUN) and serum creatinine(SCr) were detected with picric acid method and enzyme coupling rate method, the malondialdehyde(MDA) content in myocardial tissue was determined by thiobarbituric acid colorimetric method. The renal morphology change was observed by HE staining. The PrxⅢ mRNA and protein expression in myocardium were evaluated by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR) and western blot. Results Compared with the control group, the BUN and SCr in serum of renal ischemia reperfusion injury group were significantly increased. The MDA content, the PrxⅢ mRNA relative expression level and protein relative expression level in myocardium of renal ischemia reperfusion injury group were higher than that of control group, there were statistically significant difference (P<0.05). Conclusion After renal ischemia reperfusion injury, myocardial tissue appeared oxidative damage. PrxⅢ plays a role of anti oxidative stress in the heart tissue of rats with renal ischemia reperfusion injury.
[Key words] reperfusion injury; kidney; peroxiredoxin Ⅲ; rats
[中图分类号] R619.9
[文献标志码]A
[文章编号]1007-3205(2016)10-1165-05