表1 CEACAM1和VEGF在两组中的表达比较
Table 1 Expression of CEACAM1 and VEGF between the two groups (例数，%)
马 赛，安 峰*，胥爱文，王 芹，张 利，李立恒
(河北北方学院附属第一医院口腔科，河北 张家口 075000)
[摘要]目的研究癌胚抗原相关细胞黏附分子1(carcinoembryonic antigenrelated cell adhesion molecule 1，CEACAM1)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factors，VEGF) 在涎腺黏液表皮样癌(mucoepidermoid carcinoma，MEC)组织中的表达及对血管生成的影响。方法应用免疫组织化学链霉菌抗生物素-过氧化物酶连接(streptavidin-perosidase,SP)法检测70例MEC、20例正常涎腺组织中CEACAM1、VEGF的表达情况，在光镜下计数70例MEC组织中CD105标记的微血管密度(microvessel density，MVD)。结果70例MEC组织中CEACAM1蛋白阳性表达率明显低于正常涎腺组(34.3%vs70.0%,P<0.05)，VEGF蛋白阳性表达率明显高于正常涎腺组(71.4%vs10.0%,P<0.05)。在MEC组织中病理分级Ⅲ级者CEACAM1表达阳性率低于病理分级Ⅰ+Ⅱ级者(P<0.05)，TNM分期Ⅲ+Ⅳ期者CEACAM1表达阳性率低于TNM分期Ⅰ+Ⅱ期者(P<0.05)，有淋巴结转移者CEACAM1表达阳性率低于无淋巴结转移者(P<0.05)；而病理分级Ⅲ级者VEGF表达阳性率和MVD值高于病理分级Ⅰ+Ⅱ级者(P<0.05)，TNM分期Ⅲ+Ⅳ期者VEGF表达阳性率和MVD值高于TNM分期Ⅰ+Ⅱ期者(P<0.05)，有淋巴结转移者VEGF表达阳性率和MVD值高于无淋巴结转移者(P<0.05)。结论MEC组织中CEACAM1表达下调可能促进了VEGF的表达，从而参与MEC组织当中血管的生成，促进其侵袭和转移。
[关键词]癌，黏液表皮样；血管内皮生长因子类；血管生成
黏液表皮样癌(mucoepidermoid carcinoma，MEC)是涎腺肿瘤中常见的一类恶性肿瘤。随着MEC的发展，患者的面容会受到严重影响，当肿瘤侵及神经时面部功能也会随之受到损害，造成患者生活质量下降，甚至危及患者的生命。与其他肿瘤相同，MEC组织中新生血管的数量决定了其生长、浸润、转移潜能。研究发现，肿瘤的血管生成是一个复杂的过程，受多种血管生成促进因子和抑制因子共同调控。癌胚抗原相关细胞黏附分子1(carcinoembryonic antigenrelated cell adhesion molecule 1，CEACAM1)是一种糖蛋白，它是癌胚抗原家族的成员之一，以往研究显示CEACAM1与肿瘤血管、淋巴管的生成密切相关[1-2]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factors，VEGF) 是一种已知的促进血管生成的强效因子，它通过促进相邻的血管内皮细胞增殖和转化迁移，促进血管的生成。本研究应用免疫组织化学链霉菌抗生物素-过氧化物酶连接(streptavidin-perosidase,SP)法观察MEC组织中CEACAM1、VEGF的表达情况，并测定以CD105标记的肿瘤组织微血管密度(microvessel density，MVD)，旨在探讨MEC组织中CEACAM1、VEGF表达改变与肿瘤微血管生成的关系。
1.1 材料与试剂 收集2007年6月—2016年6月河北北方学院附属第一医院口腔科收治的MEC患者70例，均有完整的临床病理资料。以上病例均经手术切除肿瘤，术前均未接受放疗、化疗及免疫治疗等其他治疗，病理标本均由资深病理科医师按照WHO(1991年)涎腺肿瘤组织病理学标准进行诊断分型。同时选取癌旁正常的涎腺组织20例作为对照组。兔抗人CEACAM1单克隆抗体购自美国Epitomics公司，鼠抗人VEGF单克隆抗体购自美国Labvision公司，鼠抗人CD105单克隆抗体购自NeoMarkers公司，免疫组织化学SP试剂盒购自北京中杉生物技术公司。
1.2 标本处理及检测方法 所用标本均由4%甲醛浸泡固定24 h，常规石蜡包埋、切片，并贴附于1%多聚赖氨酸处理后的载玻片上，65 ℃烤片1 h。免疫组织化学SP法检测按试剂盒上说明的步骤进行。兔抗人CEACAM1单克隆抗体效价为1∶200，鼠抗人VEGF单克隆抗体效价为1∶100，以PBS代替一抗作为阴性对照，用已知阳性标本作为阳性对照。
1.3 结果判定
1.3.1 CEACAM1、VEGF表达阳性的判定标准 细胞膜和(或)细胞质被染成棕黄色的细胞被判定为表达阳性细胞。在显微镜高倍视野下(×200)随机选取5个视野，根据每个视野中阳性细胞的百分比和染色程度对标本进行评分。细胞计数：无阳性细胞为0分，<25%为1分，25%～50%为2分，>50%为3分。染色程度：基本不着色为0分，着色淡为1分，着色适中为2分，着色深为3分。细胞计数得分与染色程度得分2项相加，得分>3分被认定为阳性，≤3分认定被为阴性。
1.3.2 CD105表达阳性的判定标准及标本MVD计数方法 血管内皮细胞膜和(或)细胞质被染成棕黄色或棕褐色视为CD105表达阳性。根据Weidner[3]提出的方法计数标本的MVD值：在显微镜低倍视野下(×10)选取肿瘤微血管密度较高的区域，再在高倍视野下(×200)计数微血管的数目，每张切片选取5个高倍视野进行计数，取平均值作为该标本的MVD值。
1.4 统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件处理数据。计量资料比较采用t检验；计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 CEACAM1、VEGF在MEC组织中的表达 CEACAM1和VEGF的阳性颗粒均集中在细胞质或细胞膜中(图1～4)，70例标本当中CEACAM1阳性表达率分为34.3%(24/70)，明显低于正常涎腺组织中的70.0%(14/20)，VEGF阳性表达率为71.4%(50/70)，明显高于正常涎腺组织中的10.0%(2/20)。见表1。
2.2 MEC患者不同病理特征的CEACAM1、VEGF和MVD表达 在MEC组织中病理分级Ⅲ级者CEACAM1表达阳性率低于病理分级Ⅰ+Ⅱ级者(P<0.05)，TNM分期Ⅲ+IV期者CEACAM1表达阳性率低于TNM分期Ⅰ+Ⅱ者(P<0.05)，有淋巴结转移者CEACAM1表达阳性率低于无淋巴结转移者(P<0.05)，不同性别、年龄和肿瘤部位CEACAM1表达阳性率差异无统计学意义(P>0.05);VEGF与MVD表达相反，病理分级Ⅲ 级者VEGF表达阳性率和MVD值高于病理分级Ⅰ+Ⅱ级者(P<0.05)，TNM分期Ⅲ+Ⅳ期者VEGF表达阳性率和MVD值高于TNM分期Ⅰ+Ⅱ期者(P<0.05)，有淋巴结转移者VEGF表达阳性率和MVD值高于无淋巴结转移者(P<0.05)，不同性别、年龄、病变部位VEGF表达阳性率和MVD值差异无统计学意义(P>0.05)。见表2，图5。
表1 CEACAM1和VEGF在两组中的表达比较
Table 1 Expression of CEACAM1 and VEGF between the two groups (例数，%)
图1 MEC组织中CEACAMI的表达情况(SP×200)
Figure 1 expression of CEACAMI in mucopidermoid carcinoma(SP×200)
图2 MEC组织中VECF的表达情况(SP×200)
Figure 2 Expression of VECF in mucoepidermoid carcinoma(SP×200)
图3 正常涎腺组织中CEACAM1的表达情况(SP ×200)
Figure 3 Expression of CEACAM1 in normal salivary gland(SP ×200)
图4 正常涎腺组织中VEGF的表达情况(SP ×200)
Figure 4 Expression of VEGF in normal salivary gland(SP ×200)
图5 MEC组织中CD105的表达情况(SP ×200)
Figure 5 Expression of CD105 in mucoepidermoid carcinoma(SP ×200)
表2 MEC中不同病理特征CEACAM1和VEGF的表达及MVD值
Table 2 Expression of CEACAM and VEGF in different pathological features and MVD value in MEC
MEC是口腔颌面部最常见的唾液腺恶性肿瘤之一，占涎腺上皮性恶性肿瘤30%左右。可发生于任何年龄段，其中又以40～60岁为发病高峰，女性多于男性。腮腺、颌下腺、腭腺、磨牙后腺等腺体均可发生，因其发病隐匿，早期无明显症状，病史通常较长。黏液表皮样癌根据其发生部位、分化程度、恶性程度、有无转移等方面的差异，治疗方法及预后也有所不同[4-5]。如果临床医师能够更准确地了解、评估工作中遇到的MEC，那么临床上对MEC的治疗水平必将显著提高。
CEACAM1是免疫球蛋白超家族之中的一员，它可以参与细胞黏附、细胞信号通路传导以及各种复杂的生物学进程，并且在血管生成、血运转移、肿瘤进展中发挥着重要的作用[6]。与正常组织相比，在一些恶性肿瘤中，CEACAM1表达明显减低，甚至不表达，所以人们普遍认为它是一种肿瘤抑制因子。CEACAM1表达的下调或缺失解除了机体对肿瘤细胞的抑制，可能是恶性肿瘤发生、发展的一个早期事件[2，7-8]。但是又有研究得出相反的结论，在诸如胃癌、肺癌等一部分恶性肿瘤中，CEACAM1的表达随肿瘤恶性程度的上升而升高，且能够促进肿瘤的侵袭、转移，影响患者的预后[9-11]。对于CEACAM1在不同肿瘤当中发挥不同作用的解释，目前有文献报道可能与其不同的亚型和在肿瘤细胞当中的表达部位不同有关[10]。随着研究的深入，人们越来越重视CEACAM1在肿瘤诊断、病情评估和判断预后方面的重要性。目前，已有学者尝试通过检测患者血清当中CEACAM1的表达来预测肿瘤的发生、发展[12]。而CEACAM1在涎腺MEC组织中的表达情况及与肿瘤血管生成的关系如何，国内外均未见报道。本研究结果显示，CEACAM1在MEC中的阳性表达率明显低于正常涎腺组织(P<0.05)，且其表达随涎腺MEC恶性程度的增高而降低，肿瘤侵犯的范围越广，其阳性表达率也越低，当出现淋巴结转移时，其阳性表达率也随之降低。这说明在涎腺MEC当中，CEACAM1起到肿瘤抑制因子的作用，当患者组织中CEACAM1表达降低时，提示可能肿瘤组织的恶性程度较高，预后不良。
恶性肿瘤发生、发展的过程离不开新生血管的形成，而新生血管形成是一个复杂的、多基因共同参与调控的过程。VEGF是目前公认的促进肿瘤血管生成的关键性因子[13]。VEGF在恶性肿瘤细胞中高表达，促进了血管内皮细胞的增殖，从而形成新生的血管，为肿瘤的快速发展提供充足的养分，并且增加了肿瘤血运转移的机会。本研究结果显示，VEGF在MEC组织中的表达明显高于正常涎腺组织(P<0.05)；肿瘤的恶性程度越高、侵袭性越强，VEGF的阳性表达率越高；有淋巴结转移时，其阳性表达率也随之升高。与以往的研究结论一致[14]。
CD105是一种同型二聚体的细胞膜糖蛋白，在增殖旺盛的肿瘤组织血管内皮细胞上高表达。由于CD105能够更显著地标记肿瘤组织中新生的微小血管，故人们把CD105视为一种更优质、高效的血管内皮细胞增殖标记物，而根据它的染色评估MVD的方法也被认为能更好地量化肿瘤的MVD[15]。本研究通过标记CD105的方法来检测MEC组织的MVD值，结果显示CD105在MEC组织中阳性表达为100%，肿瘤的恶性程度越高、侵袭性越强，通过CD105标记的MVD值越大，有淋巴结转移者较无淋巴结转移者MVD值高(P<0.05)。说明CD105标记的MVD值高，很可能预示着MEC的恶性程度高，浸润、转移能力强。
本研究MEC组织中CEACAM1表达与VEGF表达、CD105标记的MVD值表达相反。说明CEACAM1过表达能够抑制肿瘤新生血管的生成。以此推断，在MEC的发生、发展过程当中，CEACAM1表达降低，VEGF表达增高，从而促进了MEC组织新生血管的形成，提高了其侵袭、转移的能力，影响了MEC的生物学行为。其作用机制可能是：CEACAM1作为VEGF的一个重要效应分子，CEACAM1的表达缺失启动了一系列促进血管生成相关的因子的高表达，如VEGF-C、VEGF-A、VEGF-D和血管生成素2等因子，从而促进了肿瘤生成新生血管[16]。但也有文献报道，CEACAM1过表达促进了肿瘤血管、淋巴管的生成，并能够促进血管内皮细胞转化成淋巴管内皮细胞[17]。至于为何CEACAM1在不同肿瘤血管生成当中发挥着截然相反的作用，其具体机制仍有待进一步研究。
综上所述，可以推断，CEACAM1低表达、VEGF高表达，并伴有较高MVD值的MEC患者，可能预示着其肿瘤恶性程度高、侵袭性强、转移率高、预后较差。通过检测CEACAM1、VEGF的表达，并计数CD105标记的MVD值，有助于预测涎腺MEC的恶性程度及预后情况。进一步研究在MEC组织中CEACAM1与VEGF之间如何相互作用，在这一过程中是否还有其他因子参与调控及其调控的方式，有望为涎腺MEC的精准化治疗提供科学依据。
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(本文编辑：许卓文)
MA Sai, AN Feng*, XU Ai-wen, WANG Qin, ZHANG Li, LI Li-heng
(Department of Stomatology， the First Affiliated Hospital of Hebei North College， ZhangJiakou 075000， China)
[Abstract]Objective To investigate the relationship of carcinoembryonic antigen related cell adhesion molecule 1 (CEACAM1) and vascular endothelial growth factors (VEGF) expression with angiogenesis in mucoepidermoid carcinoma(MEC) of salivary glands. Methods The expression of CEACAM1 and VEGF was detected with immunohistochemcal method streptavidin-perosidase (SP) in 70 cases of MEC tissues，and 20 cases of normal salivary gland，the microvessel density(MVD) was recorded under optical microscope. Results The positive expressions of CEACAM1 protein (34.3%vs70.0%) was lower in MEC group than those in normal salivary gland group(P<0.05)，the positive expressions of VEGF protein (71.4%vs10.0%) was higher in MEC group than those in normal salivary gland group(P<0.05). In MEC group，the positive expressions of CEACAM1 protein in pathological grade levelⅢ patients were lower than those in pathological grade level Ⅰ+Ⅱ patients(P<0.05)，the positive expressions of CEACAM1 protein in TNM stage Ⅲ+Ⅳpatients were lower than those in TNM stageⅠ+Ⅱ patients(P<0.05)，the positive expressions of CEACAM1 protein in patients with lymph node metastasis were lower than that in patients without lymph node metastasis(P<0.05). The positive expressions of VEGF protein and MVD in pathological grade level Ⅲpatients were higher than those in pathological grade level Ⅰ+Ⅱpatients(P<0.05)，the positive expressions of VEGF protein and MVD in TNM stage Ⅲ+Ⅳ patients were higher than those in TNM stage Ⅰ+Ⅱpatients(P<0.05)，the positive expressions of VEGF protein and MVD in patients with lymph node metastasis were higher than that in patients without lymph node metastasis(P<0.05). Conclusion Downregulationg of CEACAM1 in MEC of salivary glands may play a role in angiogenesis through increasing the expression of VEGF，thus promote tumor invasion and metastasis.
[Key words]carcinoma, mucoepidermoid； vascular endothelial growth factors； angiogenesis
[收稿日期]2016-10-11；
[修回日期]2016-11-26
[基金项目]河北省医学科学研究重点课题(20150059)；河北省政府资助临床医学优秀人才培养和基础课题研究项目(361009)；张家口市科学技术研究与发展指导计划(1421128D)
[作者简介]马赛(1984-)，男，河北望都人，河北北方学院附属第一医院主治医师，医学硕士，从事口腔科疾病诊治研究。
[中图分类号]R730.26
[文献标志码]A
[文章编号]1007-3205(2017)01-0043-05
doi：10.3969/j.issn.1007-3205.2017.01.010
*通讯作者