表示，组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。韩 华1，赵红伟2，闫 萍1，王晓娜1
(1.河北省人民医院妇一科,河北 石家庄 050051;2.河北省人民医院消化科,河北 石家庄 050051)
[摘要]目的观察不同作用时间的米非司酮对早孕蜕膜、绒毛组织超微结构的影响，探讨药物流产中缩短米非司酮与米索前列醇用药间隔的可行性。方法随机选取自愿要求中止妊娠的早孕妇女80例，分为对照组、12 h组、24 h组、48 h组各20例。对照组直接行负压吸引术；3个用药组顿服米非司酮150 mg，之后于不同时间行负压吸引术；留取各组蜕膜、绒毛组织。应用透射电镜观察各组蜕膜、绒毛组织的超微结构改变。结果对照组蜕膜细胞体积较大，胞质内细胞器丰富；合体滋养细胞表面有大量微绒毛。12 h组蜕膜细胞胞质内充满大量囊性扩张的粗面内质网，线粒体的部分嵴和膜融合、缺失，颗粒细胞中高电子密度颗粒数量减少或消失，细胞周围胶原纤维排列紊乱、断裂，甚至崩解；合体滋养细胞表面微绒毛数量减少，细胞质高度水肿，细胞滋养细胞变扁变小，轮廓不清。24 h组、48 h组与12 h组大致相同。结论米非司酮作用后12 h蜕膜、绒毛组织已经发生变性坏死，为缩短米非司酮的用药时间提供了形态学方面理论依据。
[关键词]米非司酮；作用时间；蜕膜；绒毛；超微结构
米非司酮是一种类固醇样化合物，其结构类似炔诺酮，化学名称是11β-[4-(N,N-二甲氨基)]苯基-17β-羟基-17α-(1-丙炔基)-雌甾-4，9-二烯-3-酮。米非司酮通过与孕激素受体结合起到阻断孕激素的作用，引起蜕膜、绒毛组织变性坏死，从而诱发流产。经过多年研究和临床应用，其抗早孕作用已经得到充分肯定。在我国，米非司酮配伍米索前列醇中止早孕已作为一种最常用的药物流产方案广泛应用于临床[1-2]。因药物流产较人工流产具有简便、痛苦轻、精神负担小等优点，越来越受到广大妇女的青睐[3]。目前国内常用的药物流产方案为米非司酮150 mg顿服或分次服用，48 h后口服米索前列醇600 μg[4]。这种用药方案虽然比较成熟，但持续时间较长，给早孕妇女带来许多不便和心理压力[5]。近年来国内外学者已进行了一系列有关缩短米非司酮与米索前列醇用药间隔的临床研究[6]，并显示简化药物流产方案在临床上具有可行性，但缺乏充足的理论依据。本研究从米非司酮中止早孕的作用机制出发，观察米非司酮作用不同时间后人早孕蜕膜、绒毛组织超微结构的变化，分析米非司酮对蜕膜、绒毛组织的影响，旨在为临床缩短米非司酮和米索前列醇用药间隔提供理论基础。现报告如下。
1.1 一般资料 选择河北省人民医院妇产科门诊自愿要求中止早期妊娠的妇女80例，年龄18～40岁，停经时间<49 d，经妇科检查、尿妊娠试验及妇科B超检查证实为宫内早孕，平时月经规律，半年内未服用激素类药物，无生殖系统炎症及肿瘤。将研究对象随机分为4组各20例。对照组：年龄(29.6±5.12)岁，停经时间(43.05±4.63) d，胎囊大小(21.60±3.95) mm，采用常规负压吸引术中止妊娠；12 h组：年龄(28.7±5.77)岁，停经时间(42.90±4.29) d，胎囊大小(21.05±3.05) mm，口服米非司酮150 mg，12 h后行负压吸引术；24 h组：年龄(28.5±5.86)岁，停经时间(41.65±3.82)d，胎囊大小(20.65±2.92)mm，口服米非司酮150 mg，24 h后行负压吸引术；48 h组：年龄(29.1±5.38)岁，停经时间(42.50±5.04) d，胎囊大小(21.35±4.12) mm，口服米非司酮150 mg，48 h后行负压吸引术。分别留取4组的新鲜蜕膜和绒毛组织。4组年龄、停经时间、胎囊大小差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。
本研究均获得患者及家属知情同意，并经医院伦理委员会批准。
1.2 主要试剂及仪器 米非司酮，25 mg/片(浙江仙居制药股份有限公司)。普通光学显微镜(日本Olympus光学工业株式公司)，Nikon尼康全自动显微照相机(日本株式会社尼康)，Leica UCT 超薄切片机(德国Leica公司)，H-7500型透射电子显微镜(日本日立公司)。
1.3 实验方法 取新鲜的蜕膜、绒毛组织，分别固定于4%多聚甲醛，常规梯度酒精脱水，苏木精染色，伊红染色，二甲苯透明，中性树胶封片，然后在光镜下观察组织形态。
透射电镜样品的制作：将新鲜的蜕膜、绒毛组织切成大小约1 mm3的小块放入4%戊二醛中前固定(1 h，4 ℃)，每组随机选取其中6例，用磷酸缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)清洗3次，每次10 min，放入1%锇酸中后固定(2 h，4 ℃)，再用PBS清洗3次，每次10 min，然后乙醇梯度逐级脱水50%、70%、80%、90%、100%Ⅰ、100%Ⅱ，每步10 min，再用100%丙酮脱水2次，各10 min；用丙酮与树脂3∶1，1∶1，1∶3的混合液各浸透15 min，然后纯树脂浸透30 min；将样品放入盛有环氧树脂812、815包埋液的包埋板中进行包埋，然后置于37 ℃、45 ℃、60 ℃的烤箱中聚合，各24 h；用Leica超薄切片机将样品切成厚50 nm的超薄切片，用醋酸铀室温下染色30～45 min，柠檬酸铅室温下染色30 min，然后使用日立H-7500型透射电子显微镜观察、照相。
1.4 统计学方法 应用SPSS 13.0统计软件进行数据处理，计量资料以表示，组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 光镜下蜕膜、绒毛组织形态学改变 经HE染色，光镜下观察可见对照组蜕膜组织有蜕膜细胞和颗粒细胞，蜕膜细胞体积大，呈砖砌状，多边形，核椭圆形，胞浆丰富，结构完整，排列紧密，颗粒细胞胞核扭曲，这2种细胞周围有细密的网状纤维围绕，并可见腺体，呈高度分泌相；绒毛滋养层细胞结构清晰，外层为合体滋养细胞，内层为细胞滋养细胞，为单层立方形细胞，细胞界限清晰，胞浆透明，核圆浅染；绒毛间质疏松，可见毛细血管及梭形结缔组织细胞。12 h组蜕膜细胞呈灶性或片状变性、坏死，间质水肿、出血，毛细血管扩张充血，有炎性细胞浸润，蜕膜细胞相互间隙增大，细胞间有出血；绒毛滋养层细胞变性、坏死，甚至脱落，并可见到炎细胞浸润；绒毛间质水肿，内有血液瘀积和纤维素沉积(图1)。24 h组、48 h组与12 h组形态改变基本相同，48 h组可见大片组织坏死。
2.2 电镜下蜕膜、绒毛组织超微结构改变 对照组蜕膜组织中包含2种不同结构特征的细胞，即蜕膜细胞和颗粒细胞。蜕膜细胞体积较大，外形不规则，核椭圆形，常染色质丰富，异染色质较少，有大而明显的核仁，胞质内细胞器丰富，可见许多线粒体和发达的轻度扩张的粗面内质网，细胞表面有一些细长的突起。颗粒细胞体积较小，胞核扭曲，异染色质边聚，核仁较少，胞质内含有丰富的高电子密度颗粒，以及大量的线粒体和少量的粗面内质网，细胞间胶原纤维丰富。绒毛组织合体滋养细胞表面有大量微绒毛，细胞核形不规则，常染色质丰富，核仁明显，胞质内含有丰富的粗面内质网、线粒体和游离核糖体，可见少量脂滴。细胞滋养细胞位于基膜之上，呈椭圆形，胞质内细胞器较少，有数量不等的线粒体、粗面内质网。合体滋养细胞与细胞滋养细胞之间呈桥粒连接(图2)。
12 h组蜕膜细胞胞质内充满大量囊性扩张的粗面内质网，线粒体的大部分嵴和部分膜融合，模糊不清或缺失。颗粒细胞中高电子密度颗粒数量减少或消失，粗面内质网扩张，有脱颗粒现象，游离的核糖体增多，胞质内可见大小不等的空泡，细胞周围胶原纤维排列紊乱、断裂，甚至崩解。绒毛合体滋养细胞表面微绒毛数量减少，细胞质高度水肿，粗面内质网轻度扩张，线粒体部分嵴融合、消失，游离核糖体减少，可见脂滴。细胞滋养细胞变扁变小，细胞轮廓不清，粗面内质网高度不规则扩张，腔内有分泌物，有轻度脱颗粒现象。合体滋养细胞与细胞滋养细胞之间的连接结构松弛，细胞间隙增宽(图3)。
24 h组、48 h组蜕膜、绒毛组织超微结构与12 h组基本相同。
图1 光镜下形态改变(×200) A.对照组蜕膜组织；B.对照组绒毛组织；C.12 h组蜕膜组织；D.12 h组绒毛组织
图2 对照组超微结构(×4 000) A.蜕膜细胞；B.颗粒细胞；C.合体滋养细胞；D.郎格汉斯细胞
图3 12 h组超微结构(×4 000) A.蜕膜细胞；B.颗粒细胞；C.合体滋养细胞；D.郎格汉斯细胞
全世界每年约有5 300万非计划妊娠女性自愿要求中止妊娠，其中大多数发生在妊娠的前3个月。人工流产虽然是一种安全有效的中止妊娠的方法，但却给患者带来了很大的痛苦和精神负担，使许多女性望而却步。药物流产作为一种非手术中止早期妊娠的途径，为广大女性提供了一种简便、安全、高效的抗早孕方法，在临床得到广泛应用[7]。我国从1991年开始进行国产米非司酮临床研究，经过20多年的基础和临床研究，应用米非司酮配伍米索前列醇已经成为最常用的药物流产方案。有关流产方案中米非司酮与米索前列醇的最佳配伍方法，至今众说纷纭，尚无统一的用法[8-9]。公认的药物流产方案中，米非司酮与米索前列醇的用药时间间隔为48 h或72 h，但此种用法持续时间较长，胎囊滞留体内较久，引起的胃肠道反应及阴道不规则出血给许多早孕妇女造成很大的精神负担。目前已有相关临床研究表明，缩短米非司酮与米索前列醇两者的用药间隔可以降低药物流产的失败率，减轻药物不良反应，提高早孕妇女对药物流产的接受程度，但目前尚无定论，这就需要进一步探讨，以提供充足的理论依据。正常妊娠的发生发展是一个复杂的生理过程，许多甾体激素、细胞因子、生长因子、黏附分子和趋化因子等都参与整个过程的调节，它们之间相互作用，在建立和维持妊娠过程中发挥重要作用[10-11]。蜕膜便是受这些诱导因子刺激后由子宫内膜增殖和再分化形成的，是母胎界面之间一个非常复杂而又高度协调的微环境[12]。蜕膜组织对正常的胚胎着床、妊娠建立和维持，以及分娩发动均起着非常关键的作用。如果蜕膜组织异常，就会引起流产、胎盘缺陷、宫内发育迟缓以及早产等，进而影响妊娠结局。而孕激素是维持早孕蜕膜、绒毛正常形态和功能的重要因素，阻断孕激素效应将会影响妊娠的继续发展[13]。米非司酮和孕激素同属于甾体，两者的化学结构相似，前者与孕激素受体的结合能力为孕激素的3～5倍，可阻断孕激素与其受体的结合及孕激素活性的呈现，使蜕膜、绒毛组织失去孕激素的支持，继而变性坏死，出血脱落，导致流产[14-15]。
本研究通过透射电镜观察发现，正常早孕绒毛组织表面有大量微绒毛，蜕膜组织中细胞间胶原纤维丰富，排列整齐，颗粒细胞的胞浆内有大量高电子密度颗粒。这些颗粒的主要成分是松弛素，其作用是使蜕膜中的网状纤维分解，继而引起间质细胞分离、脱落。而松弛素的释放又受体内孕激素水平的影响，当孕激素水平下降时，颗粒细胞内分泌颗粒大量释放，激活松弛素。在米非司酮作用后12 h，颗粒细胞中高电子密度颗粒数量明显减少或消失，蜕膜细胞内粗面内质网扩张，线粒体融合消失，胶原纤维排列紊乱、断裂，甚至崩解。绒毛表层的合体滋养细胞表面微绒毛减少、脱落，细胞内粗面内质网扩张，有脱颗粒现象。24 h组及48 h组的超微结构改变与12 h组基本相同。这从形态学角度说明米非司酮作用12 h后，体内孕激素生物活性便受到抑制，导致颗粒细胞内分泌颗粒的释放并激活松弛素，引起蜕膜组织网状纤维溶解、断裂，使绒毛及蜕膜组织细胞脱落，从而引发流产。
综上所述，从米非司酮作用后蜕膜、绒毛组织的超微结构改变来看，米非司酮作用后最早12 h就引发组织变性坏死，为缩短米非司酮的作用时间、简化药物流产方案提供了形态学方面的理论依据。
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(本文编辑：赵丽洁)
[收稿日期]2016-01-28；
[修回日期]2016-03-08
[作者简介]韩华(1982-)，女，河北邯郸人，河北省人民医院主治医师，医学硕士，从事妇产科疾病诊治研究。
[中图分类号]R715.2
[文献标志码]B
[文章编号]1007-3205(2017)01-0089-04
doi：10.3969/j.issn.1007-3205.2017.01.021