·论 著·
涂金晶，张 鑫，刘 青
(延安大学附属医院超声科，陕西 延安 716000)
[摘要]目的探讨连环蛋白P120ctn和核增殖相关蛋白Ki67表达对乳腺癌超声征象的影响。方法选择乳腺癌患者组织标本124例，对相关生物样本的分析按照乳腺癌诊治规范进行。分析所有样本的超声征象，如肿块边缘、大小、形态、钙化区域、淋巴结转移、血流显像分级等；采用免疫组织化学法检测组织样本中P120ctn和Ki67的表达水平；分析其与乳腺癌超声征象的相关性。结果Ki67在乳腺癌组织中呈现阳性表达，P120ctn在乳腺癌组织中呈现阴性表达；在不同肿块直径和边缘存在毛刺的组织中，P120ctn和Ki67的表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)，而在不同肿块形态、不同分布的微小钙化点、不同血流显像分级和发生淋巴结转移与否的组织中，P120ctn和Ki67的表达差异均有统计学意义(P<0.05)。P120ctn蛋白和Ki67蛋白表达与超声征象中的肿块形态、微小钙化点分布、血流显像分级和淋巴结转移特点存在联系。Ki67和P120ctn蛋白表达之间呈正相关(P<0.05)。结论超声征象与P120ctn蛋白和Ki67蛋白表达之间存在一定的联系，可以作为无创性预测乳腺癌患者P120ctn蛋白和Ki67蛋白表达的方式，为乳腺癌恶变程度和预后的判断提供更多的依据。
[关键词]乳腺肿瘤；连环蛋白；核增殖相关蛋白
乳腺癌是发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤，乳腺本身不是维持人体生命活动的重要器官，故原位乳腺癌并不致命；但若失去了正常细胞特性的乳腺癌细胞发生脱落，成为游离的癌细胞，则有可能随血液或淋巴液播散全身，转移到肝、肺、肾等其他重要的组织器官中，危及生命[1]。近年来，由于环境污染的加剧和生活压力的加大，女性罹患乳腺癌的比例逐年升高，且患病年龄呈现年轻化的趋势[2]。目前，为了能及时诊断出乳腺癌，并在早期即开始治疗，影像学手段和分子生物学技术都被运用到乳腺癌的早期诊断中[3]。彩色多普勒超声检查是在乳腺癌早期诊断中运用最广泛的影像学手段。Ki67是一种用来有效评估乳腺肿瘤细胞增殖活性的核增殖相关蛋白，它已被广泛地运用到乳腺癌诊断和病情发展判断中。研究显示Ki67在乳腺癌发生发展和转移过程中都起到了重要的作用[4]。连环蛋白既是一种细胞黏附分子，又同时参与细胞信号转导过程，P120ctn是连环蛋白家族的一员，P120ctn可以与转录抑制因子kaiso结合，参与到Wnt信号通路的信号转导中。研究表明Wnt信号通路与细胞正常增殖、生长和分化密切相关[5]。细胞内P120ctn表达的缺失也与乳腺癌的发生发展有关。Ki67和P120ctn同时与肿瘤细胞的增殖生长有关，共同研究这两者在乳腺癌组织中的表达，将有助于了解两者之间是否存在联系。本研究旨在探讨连环蛋白P120ctn和核增殖相关蛋白Ki67的表达对乳腺癌超声征象的影响，从而揭示乳腺癌发病可能的生物学机制。
1.1 一般选择 选择2012年3月—2015年3月在我院进行检查和治疗的乳腺癌患者124例，得到124例符合要求的乳腺癌组织标本。患者均为女性患者，年龄34～67岁，平均(49.8±4.6)岁；其中浸润性导管癌84例、浸润性小叶癌27例、勃液腺癌13例。
1.2 纳入标准和排除标准 纳入标准：①诊断符合卫生部2011年8月12日正式颁布的《乳腺癌诊断》标准[6]：②心智健全，有自主判断能力；③手术取组织样本前未接受任何形式的放疗或化疗。排除标准：①存在肝肾等其他主要脏器耗损性疾病患者；②凝血系统功能异常或近1个月内服用过抗凝药物的患者。
本研究所有组织样本均经过患者本人确认同意，所有参与者均签署知情同意书，整个研究过程在医院伦理委员会监督下完成。
1.3 研究方法 所有受试者术前均进行彩色多普勒超声检查，受试者取仰卧位，根据由乳腺到腋窝的顺序采用高频探头进行检查。记录肿块边缘清晰与否，肿块大小和形态，肿块周边血流分布情况，血流显像的Adler分级处于0～1级或是2～3级，是否存在淋巴结转移，钙化区域的分布位置和形态。
所有受试者手术中切除的组织样本均放入10%的中性甲醛溶液中进行固定，并进行石蜡包埋，而后将其制成4 μm的组织切片，用于检测P120ctn和Ki67表达，检测方法为免疫组织化学的链霉菌抗生物素-过氧化物酶连接法(streptavidin-perosidase,SP)。阴性对照为PBS代替一抗。抗体来源于美国Invitrogen 公司的Ki67兔多克隆抗体(SP5)，北京博奥森生物技术有限公司的P120连接素鼠抗人单克隆抗体。组织切片置入缓冲液中进行抗原高温修复，持续20 min后用PBS进行冲洗，每次持续5 min，冲洗次数为3次。加入相应抗体，在4 ℃环境下放置超过8 h。再用PBS进行冲洗，每次持续2 min，冲洗次数为3次。加入聚合物辅助剂pv-9000，放置20 min，再用PBS进行冲洗，每次持续2 min，冲洗次数为3次。加入pv-9000试剂二，放置20 min，再用PBS进行冲洗，每次持续2 min，冲洗次数为3次。染色。
1.4 观察指标 本研究主要观察免疫组织化学检测结果，在显微镜下观察，若细胞中出现棕黄色的细小颗粒即为P120ctn蛋白和Ki67蛋白的阳性染色。每一张切片取400倍镜下的任意10个视野，计数每一个视野中的100个细胞的染色状况。计算出现阳性染色的细胞数目、染色强度，并进行评分。细胞数目项：若阳性染色细胞数目<10%，计1分；若阳性染色细胞数目在10%～50%，计2分；若阳性染色细胞数目>50%～75%，计3分；若阳性染色细胞数目>75%，计4分。染色强度项：颗粒为淡黄色计1分；颗粒为棕黄色计2分；颗粒为棕褐色计3分。最终得分为细胞数目项得分与染色强度项得分之积。结果判定：最终得分≥3分，表示阳性；<3分，表示阴性。
1.5 统计学方法 应用SPSS 17.0统计分析软件处理数据。计数资料比较采用χ2检验；相关性采用Spearman分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 乳腺癌患者超声恶性征象检查结果 超声检查恶性征象结果显示：124例患者中，肿块直径<2 cm的51例，肿块直径≥2 cm的73例；肿块形状规则的44例，肿块形状不规则的80例；肿块边缘出现毛刺的93例；肿块出现微小钙化点的102例，其中微小钙化点呈簇状分布的36例，呈散状分布的30例，沿导管走向分布的有36例；乳腺癌出现淋巴结转移的57例；血流显像分级处于0～1级的32例，2～3级的92例。
2.2 P120ctn蛋白和Ki67蛋白表达情况 124例乳腺癌患者的免疫组织化学结果显示，P120ctn蛋白和Ki67蛋白主要在细胞核内阳性表达，只有极少部分在细胞浆中表达(图1～2)。其中，P120ctn蛋白在83例患者的乳腺癌组织中呈阴性表达，阴性表达率达66.94%；而Ki67蛋白在108例患者的乳腺癌组织中的阳性表达，其阳性表达率高达87.10%。
图1 Ki67在细胞中的染色情况
Figure 1 The staining of Ki67 in cells
图2 P120ctn在细胞中的染色情况
Figure 2 The staining of P120ctn in cells
2.3 不同超声征象之间2种蛋白的表达 在肿瘤的不同大小、不同形态、不同边缘，P120ctn的表达阴性率差异无统计学意义(P>0.05)；沿血管走向的微小钙化点P120ctn阴性表达率高于散在分布的微小钙化点者(P<0.05)；血流分级2～3级的P120ctn的阴性表达率高于血流分级0～1级者(P<0.05);有淋巴结转移者肿块P120ctn的阴性表达率高于无淋巴结转移者(P<0.05)。肿瘤块不同大小、不同边缘、不同钙化分布之间Ki67的表达阳性率差异无统计学意义(P>0.05)，不规则肿块Ki67的表达阳性率高于规则者(P<0.05)；血流分级2～3级的Ki67的表达阳性率高于0～1级者(P<0.05)； 有淋巴结转移者Ki67的表达阳性率高于无淋巴结转移者(P<0.05)。见表1。
表1 不同超声征象之间2种蛋白的表达
Table 1 The expression of the two proteins in different ultrasonic signs (例数，%)
*P<0.05与散在分布比较(χ2检验)
2.4 相关性分析 在124例乳腺癌患者的组织切片中，P120ctn和Ki67同时阳性表达的有26例，只有P120ctn阳性表达的有15例，只有Ki67阳性表达的有82例，还有2种蛋白均为阴性表达的1例。Spearman相关分析显示，乳腺癌组织中，P120ctn蛋白表达与Ki67蛋白表达之间呈负相关(P<0.05)。
表2 P120ctn蛋白与Ki67蛋白在乳腺癌组织中表达的相关性
Table 2 The correlation between P120ctn protein and Ki67 protein in breast cancer
在乳腺癌发生发展的过程中，基因P120ctn和Ki67的表达都在不同程度上与肿块的生长、浸润和转移有关。而乳腺癌肿块的不同病理时期，在影像学检查结果上又将呈现出不同的征象。Ki67是一种用来有效评估乳腺肿瘤细胞增殖活性的核增殖相关蛋白，它已被广泛运用到乳腺癌诊断和病情发展判断中。研究显示，Ki67在乳腺癌发生发展和转移过程中都起到了重要的作用[7]，若在乳腺癌早期即检出Ki67表达率显著增大，则提示该乳腺癌的恶变程度大，发生转移可能性大，肿块生长快，侵袭能力强。P120ctn是连环蛋白家族中的一员，连环蛋白既是一种细胞黏附分子，又同时参与细胞信号转导过程。P120ctn可以转移进入细胞核，与细胞核内的转录抑制因子kaiso结合，参与到Wnt信号通路的信号转导中。研究表明，Wnt信号通路与细胞正常增殖、发育和分化密切相关[8-9]。研究显示，若P120ctn表达缺失，则细胞发生癌变的概率将显著增加[10]。Ki67和P120ctn同时与肿瘤细胞的增殖生长有关，本研究联合检测这两者在乳腺癌组织中的表达，并分析两者的表达与乳腺癌超声征象之间的联系。
本研究124例乳腺癌患者的免疫组织化学结果显示，P120ctn蛋白的阴性表达率达66.94%，而Ki67蛋白的阳性表达率高达87.10%。将2种蛋白表达结果与患者的超声征象联合起来看，当超声征象提示患者的乳腺癌存在淋巴结转移或其血流显像处于2～3级时，其组织切片中P120ctn蛋白的阴性表达率显著提高，而Ki67蛋白的阳性表达率显著提高。超声征象提示乳腺癌存在淋巴结转移或乳腺癌血流显像处于2～3级时，表明该乳腺癌周围血流丰富，发生淋巴结转移的概率非常高，侵袭周围健康组织的可能性大，肿块恶变程度高。由此说明，淋巴结转移和血流显像分级超声征象提示的乳腺癌恶变程度与Ki67和P120ctn不同表达水平提示的乳腺癌恶变程度相一致。Ki67还在肿块形态规则的组织切片中高表达。在本研究中，规则的肿块主要呈现类圆形，Ki67在这类组织切片中高表达。提示类圆形的肿块恶变程度高，发生转移和侵袭的可能性大。类圆形肿块从形态上来看与周围组织黏附度较低，其内部组织结构紊乱，容易发生转移[11-13]。表明肿块形态上的超声征象也与Ki67的表达相关。P120ctn蛋白在微小钙化点沿导管走向的乳腺癌组织中阴性表达率最高。微小钙化点沿导管走向的肿块通常提示其具有明显的坏死组织，且极易进一步钙化，这类乳腺癌的恶变程度往往也较高[14-15]。由此说明，肿块微小钙化点的分布状况上的超声征象也与P120ctn蛋白的表达相关。P120ctn蛋白和Ki67蛋白在存在淋巴结转移和血流显像处于2～3级2种征象上的表达恰好相反，Ki67在类圆形肿块组织中显著阳性表达，P120ctn在微小钙化点沿导管分布的肿块组织中显著阴性表达。进一步分析P120ctn蛋白和Ki67蛋白表达的相关性显示，这2种蛋白表达存在负相关，说明在进行乳腺癌分子生物学物质检查时，将这2种蛋白联合检查可以对检查结果相互印证，并相互补充，有助于为乳腺癌恶变程度和预后的判断提供更多的依据。
综上所述，对乳腺癌患者进行彩色多普勒超声检查，得到的部分超声征象可以反映乳腺癌的恶变程度；对乳腺癌患者进行分子生物学检查，测定P120ctn蛋白和Ki67蛋白在组织中的表达也能体现乳腺癌的恶变程度；超声征象与P120ctn蛋白和Ki67蛋白表达之间存在一定的联系，可以作为无创性预测乳腺癌患者P120ctn蛋白和Ki67蛋白表达的方式，为乳腺癌恶变程度和预后的判断提供更多的依据。
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(本文编辑：许卓文)
Correlation between ultrasonic sign and the expression level of Ki67 and P120ctn in patients with breast cancer
TU Jin-jing， ZHANG Xin, LIU Qing
(Department of Ultrasound,Affiliated Hospital of Yan′an University,Yan′an716000，China)
Abstract：Objective To investigate the effect of P120ctn and Ki67 expression on breast cancer ultrasonography. Methods The breast cancer tissues of 124 patients with breast cancer who were examined and treated in our hospital. Analysis of the relevant biological samples was in accordance with the standard of diagnosis and treatment of breast cancer. The ultrasonic features of all the samples were analyzed, such as the edge, size, shape, calcification, lymph node metastasis, blood flow imaging and so on. The expression level of Ki67 and P120ctn in tissue samples was detected by immunohistochemical method, and their correlation with the ultrasonic features of breast cancer were analyzed. Results The expression of Ki67 in breast cancer tissues was positive, and the expression of P120ctn in breast cancer tissues was negative. There was no significant difference in the expression levels of P120ctn and Ki67 between the tissues with different diameters and edges(P>0.05). However, the expression of P120ctn and Ki67 were significantly different in the tissues with different shape, different distribution of microcalcifications, different blood flow imaging grade and lymph node metastasis(P<0.05). The expression of P120ctn protein and Ki67 protein was related to the shape of the tumor, the distribution of micro calcification, the grade of blood flow imaging and the characteristics of lymph node metastasis. The expression of P120ctn and Ki67 were negatively correlated(P<0.05). Conclusion The results showed that there was a certain relationship between ultrasonic signs and the expression of P120ctn protein and Ki67 protein. Ultrasonographic signs can be used as noninvasive prediction of the expression of P120ctn and Ki67 protein in patients with breast cancer to provide more evidence for the degree of malignancy and prognosis of breast cancer.
[Key words]breast neoplasms; serial protein; nuclear proliferation related proteins
[收稿日期]2016-06-29；
[修回日期]2016-07-11
[作者简介]涂金晶(1983-)，女，陕西延安人，延安大学附属医院主治医师，医学学士，从事超声医学诊断研究。
[中图分类号]R737.9
[文献标志码]A
[文章编号]1007-3205(2017)03-0316-05
doi：10.3969/j.issn.1007-3205.2017.03.017