咬合垂直距离升高对不同年龄大鼠深层咬肌重链肌球蛋白及肌源性调节因子mRNA表达的影响

(1.河北医科大学口腔医院正畸科，河北石家庄 050017；2.河北医科大学口腔医院口腔颌面外科，河北石家庄 050017)

[摘要]目的观察咬合垂直距离升高(increasing the occlusal vertical dimension,iOVD)对不同年龄大鼠深层咬肌重链肌球蛋白(myosin heavy chain，MHC)及肌源性调节因子mRNA表达的影响。方法48只雄性Wistar大鼠按月龄分为2组：青少年组(1.5月龄，n=24)、年轻成年组(8月龄，n=24)，每组24只。2组内又分别设置对照组与实验组2个亚组(n=12)，实验组磨牙放置树脂咬合板升高咬合垂直距离。即按照年龄及是否进行实验干预将实验动物分为青少年对照(teenager control，TC)组，青少年实验(teenager experimental，TE)组，年轻成年对照(young adult control，YAC)组，年轻成年实验(young adult experimental，YAE)组。使用Real-time PCR对各组深层咬肌MHC mRNA、MyoD、myogenin mRNA表达进行测定。结果MHCⅡa mRNA在7 d时，TE高于TC组，YAC、YAE组低于TC、TE组，差异有统计学意义(P<0.05)；14 d时，TE高于TC组，YAC、YAE组低于TC、TE组，YAE组高于YAC组，差异有统计学意义(P<0.05)。MHCⅡx mRNA在7、14 d时，TE、YAE组低于TC、YAC组，差异有统计学意义(P<0.05)。MHCⅡb mRNA在7 d时，TE组低于TC组，YAC、YAE组高于TC、TE组，差异有统计学意义(P<0.05)；14 d时，TE、YAE组高于TC、YAC组，YAE组高于TE组，差异有统计学意义(P<0.05)。MyoD mRNA在7、14 d时，TE、YAE组高于TC、YAC组，YAC、YAE组低于TC、TE组，差异有统计学意义(P<0.05)。myogenin mRNA和myogenin/MyoD mRNA在7、14 d时，TE高于TC组，YAE组高于YAC组，YAC、YAE组低于TC、TE组，差异均有统计学意义(P<0.05)。myogenin/MyoD mRNA比值与MHC Ⅱa mRNA之间呈正相关关系(r=0.954，P<0.05)，与MHC Ⅱb mRNA之间呈负相关关系(r=-0.755，P<0.05)。结论iOVD后青少年组大鼠的深层咬肌发生MHC Ⅱa mRNA转化的时间更早，表达量更多。MyoD和myogenin在纤维类型转变中发挥着一定的作用。

牙合与咀嚼肌处于同一口颌功能系统中，适合稳定的咬合垂直距离是充分发挥咀嚼肌的咀嚼效能、获得平衡协调面部比例的关键。同样，正常的肌肉结构与功能是维持正常咬合垂直距离的解剖基础。在正畸临床治疗过程中，经常涉及到咬合垂直距离升高(increasing the occlusal vertical dimension,iOVD)的情况。回顾性研究表明，对于大多数患者来说，深覆牙合的治疗是成功的，但临床上也有一部分患者出现深覆牙合复发的情况。越来越多的学者认为，口周肌肉的平衡协调对于矫治后的稳定性至关重要[1-2]。咬肌在维持下颌骨的位置中起着重要的作用。鉴于伦理学的限制，正畸临床上通常通过研究患者咬肌肌电活动的方法评估垂直距离升高对咬肌功能的影响，然而对咬肌形态学方面的影响鲜有报道[3-4]。因此，笔者以往的研究通过建立咬合垂直距离升高的动物模型，从组织学水平初步研究了iOVD对不同年龄大鼠深层咬肌的影响，获得了不同年龄大鼠深层咬肌在iOVD情况下纤维类型由快收缩向慢收缩转化的规律。然而，在基因水平，iOVD对不同年龄大鼠深层咬肌的影响是否与组织学水平的变化相一致尚未见报道。骨骼肌的特性之一为在外界环境及生长发育的调控下，肌纤维类型随之改变。多种分子信号通路参与调控肌纤维类型的转化，其中生肌调节因子途径为近年来研究的热点，MyoD及myogenin对于调节肌纤维类型的表达具有重要的作用[5-6]。iOVD引起的咬肌纤维类型基因水平的转化是否与这一信号分子有关？本实验拟进一步研究。

1 材料与方法

1.1 动物模型建立 48只雄性Wistar大鼠购自河北省实验动物中心，动物合格证号：SCXK(冀)2003-1-003。实验动物按照月龄分为2组：青少年组(1.5月龄)及年轻成年组(8月龄)，每组24只。2组内又分别设置对照组与实验组2个亚组，每组12只。实验组磨牙放置树脂咬合板进行iOVD。即按照年龄及是否进行实验干预将实验动物分为青少年对照(teenager control，TC)组，年轻成年对照(young adult control，YAC)组，青少年实验(teenager experimental，TE)组，年轻成年实验(young adult experimental，YAE)组。其中实验组大鼠上颌佩戴咬合板升高咬合，对照组不戴咬合板，仅进行操作对照。iOVD的方法及模型稳定性鉴定参见之前的研究[7]。

1.2 咬肌标本的采集及处理于咬合升高后7、14 d分别从4组各随机选取6只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛过量致死。深层咬肌肌腹部暴露后，迅速于深层咬肌肌腹中央位置切取组织，预冷的生理盐水漂洗组织表面血液，滤纸吸干水分，液氮速冻，铝箔纸包裹，各组标本编号后入-80 ℃冰箱冻存。

1.3.1 总RNA的提取采用Trizol一步法提取深层咬肌的总mRNA。应用分光光度仪检测各组总RNA OD260/OD280的比值，确定mRNA的纯度；采用琼脂糖凝胶电泳的方法检查RNA完整性。

1.3.2 总RNA逆转录合成cDNA第一链根据第一链cDNA反转录试剂盒(Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit,美国Thermo公司)，以总mRNA为模板合成相应的互补cDNA。吸取3 μL mRNA样本，反应体系为20 μL。反应条件为变性：65 ℃，5 min；反转录：42 ℃，60 min；灭活反转录酶：70 ℃，5 min。将合成好的 cDNA 第一链放置-80 ℃保存备用。

1.3.3 Real-time PCR扩增反应体系为20 μL。反应条件为热启动：50 ℃，2 min；95 ℃，10 min；变性：95 ℃ 20 s；退火：MHCⅡa、MHCⅡb退火温度为63.1 ℃，20 s；MHCⅡx、myogenin、myod的退火温度为59.1 ℃，20 s；72 ℃延伸31 s；共40个循环，生成溶解曲线及扩增线。其中MHCⅡa、MHCⅡb、MHCⅡx、myogenin、Myod 5种基因的引物序列见表1。

表1 Real-time PCR的引物序列
Table 1 Primers used in the Real-time PCR from 5′ to 3′ direction

1.4 MHC mRNA及MyoD、myogenin mRNA相对表达量分析各样品的目的基因和管家基因分别进行Real-time PCR反应，所得的荧光信号由ABI 7500 v2.0.1软件自动分析，采用比较阈值法来测定靶基因的相对表达。

1.5 统计学方法应用SPSS 22.0统计学软件分析数据。计量资料比较分别采用单因素方差分析和SNK-q检验；相关性采用Pearson相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RNA纯度及完整性的鉴定所有样本RNA的OD260/OD280的比值在1.8～2.0之间，证明RNA的纯度符合下游实验的要求；应用琼脂糖电泳的方法对RNA的完整性进行检测，电泳后观察可见28s和18s rRNA条带，其亮度的比例近似2倍。表示所提取的总RNA较完整，未发生降解。见图1。

2.2 熔解曲线 MHCⅡa、MHCⅡx、MHCⅡb及myogenin、MyoD的熔解曲线在扩增产物的熔解温度上(Tm值)均有唯一的特征峰，说明引物设计合理，无非特异性产物出现。见图2，3。

图3 MHCⅡx、MyoD、myogenin的熔解曲线

Figure 3 Melt curves of MHCⅡx,MyoD and myogenin

基线平滑无上扬，Ct值在合适范围，说明引物的特异性，扩增效率及模板的量均符合要求。见图4，5。

图4 MHCⅡa 及MHCⅡb mRNA的扩增曲线

Figure 4 Amplification curves of MHCⅡa and MHCⅡb

图5 MHCⅡx、MyoD、myogenin的扩增曲线

Figure 5 Amplification curves of MHCⅡx,MyoD and myogenin

2.4 不同组MHCⅡmRNA的表达水平 MHCⅡa mRNA在7 d时，TE高于TC组，YAC、YAE组低于TC、TE组，差异有统计学意义(P<0.05)；14 d时，TE高于TC组，YAC、YAE组低于TC、TE组，YAE组高于YAC组，差异有统计学意义(P<0.05)。MHCⅡx mRNA在7 、14 d时，TE、YAE组低于TC、YAC组，差异有统计学意义(P<0.05)。MHCⅡb mRNA在7 d时，TE组低于TC组，YAC、YAE组高于TC、TE组，差异有统计学意义(P<0.05)；14 d时，TE、YAE组高于TC、YAC组，YAE组高于TE组，差异有统计学意义(P<0.05)。MyoD mRNA在7、14 d时，TE、YAE组高于TC、YAC组，YAC、YAE组低于TC、TE组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 不同组MHCⅡa、MHCⅡx及MHCⅡb mRNA表达水平
Table 2 mRNA levels of MHCⅡa,MHCⅡx and MHCⅡb in different groups

2.5 不同组MyoD、myogenin及myogenin/MyoD mRNA水平的比较 MyoD mRNA在7、14 d时，TE、YAE组高于TC、YAC组，YAC、YAE组低于TC、TE组，差异有统计学意义(P<0.05)。myogenin mRNA与myogenin/MyoD mRNA在7、14 d时，TE高于TC组，YAE组高于YAC组，YAC、YAE组低于TC、TE组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 不同组MyoD、myogenin及myogenin/MyoD mRNA表达水平
Table 3 mRNA levels of MyoD,myogenin and myogenin/MyoD in different groups

2.6 myogenin/MyoD mRNA比值与重链肌球蛋白各亚型mRNA表达水平的相关性分析咬合垂直距离升高可使青少年及年轻成年大鼠深层咬肌的MyoD及myogenin mRNA水平均有所增加，而myogenin mRNA较MyoD mRNA升高的更多。myogenin/MyoD mRNA与MHCⅡa mRNA存在正相关关系(r=0.954，P<0.05)，与MHCⅡb mRNA之间存在负相关关系(r=-0.755，P<0.05)。

3 讨论

随着人们口腔保健意识的提高，除了青少年患者，更多的成年患者也开始有正畸诉求。在正畸临床工作中，经常涉及到深覆牙合病例的治疗[10]。虽然对于大多数患者来说，治疗是成功的，但临床上发现其中一部分患者有深覆牙合复发的情况，且成年患者多见。由于正常的肌肉结构与功能是维持正常咬合垂直距离的解剖基础。因此，根据上述现象笔者提出假设：成年患者较青少年患者口周肌肉类型改变的时间及程度不一，从而导致iOVD后治疗的稳定性不同。咬肌为口周肌中维持下颌骨位置的重要肌肉，分为深浅两层，其中深层咬肌走行更接近于垂直向，故咬合升高时对深层咬肌的拉伸程度更大[11]，这也是笔者选取深层咬肌进行研究的原因。有研究表明，骨骼肌在被动拉伸时，可以使重链肌球蛋白向慢收缩、抗疲劳的类型进行转化[12]。在此种变化过程中，较之于组织、蛋白水平的变化，重链肌球蛋白 mRNA表达的变化更加敏感和迅速。因此，本实验采用Real-time PCR技术检测iOVD后深层咬肌重链肌球蛋白mRNA水平的变化。

3.1.1 年龄对重链肌球蛋白mRNA相对表达量的影响观察期内，青少年对照组较年轻成年对照组具有较高的MHCⅡa mRNA水平，而MHCⅡb mRNA水平较低，这与笔者先前的组织学分析结果相一致。推测不同年龄间MHCⅡa mRNA与MHCⅡb mRNA水平的差别可能是与2组间具有不同的体内激素水平以及不同的咀嚼方式有关[13]。

3.1.2 iOVD对重链肌球蛋白mRNA相对表达量的影响与青少年实验组相比，iOVD后年轻成年实验组组大鼠MHCⅡa mRNA的相对表达量增加及MHCⅡb mRNA的相对表达量降低出现的时间较晚，且程度较低。这与学者关于增加肌肉负荷后重链肌球蛋白变化的结果相一致[14-15]。推测这可能是在青春期矫治深覆牙合后OVD更稳定的原因。同时这也提示对于年轻成年患者进行iOVD治疗后需要更长期的保持。而对于MHCⅡx mRNA来说，在不同年龄实验组中是降低的，这也印证了肌肉功能改变使中间型纤维不断向对应肌纤维类型转化的现象。这与笔者先前关于iOVD对于咬肌结构影响的研究相一致[7]。

3.2 iOVD对不同年龄大鼠深层咬肌MHC亚型mRNA转化机制的探讨影响骨骼肌转化的信号通路有许多种，其中生肌调节因子(myogenic regulatory factors,MRFs)途径在骨骼肌的发生及分化中起重要的调节作用。MRFs包括myogenin、MyoD、myf5、和MRF4。在这4种生肌调节因子中，MyoD及myogenin对于调节肌纤维类型的表达具有重要的作用[16-17]。一般来说，MyoD主要在快肌中表达，而myogenin主要在慢肌中表达[18-19]。本研究结果表明，青少年大鼠的MyoD及myogenin的mRNA含量均大于年轻成年组大鼠，iOVD刺激可以使青少年及年轻成年组大鼠深层咬肌的MyoD及myogenin mRNA表达水平增加。这与机械拉伸对肌肉中MyoD及myogenin mRNA表达水平的影响得出的结论一致[20]。

咬合升高后MyoD及myogenin mRNA相对表达量均较同一年龄的对照组升高，故应分析二者比值在影响快慢肌表达中的作用。本实验又进一步对myogenin/MyoD mRNA的比值进行了分析，发现在青少年对照组大鼠较年轻成年组对照组大鼠有更高的myogenin/MyoD mRNA比值。在咬合升高组，不同年龄的大鼠其myogenin/MyoD mRNA比值有所增高，青少年实验组myogenin/MyoD mRNA比值高于且增高时间早于年轻成年实验组。上述变化趋势与MHCⅡa mRNA的变化趋势类似。

为了分析上述2种生肌调节因子mRNA与重链肌球蛋白各亚型mRNA之间的联系，笔者又对二者进行了双变量相关分析，结果发现myogenin/MyoD mRNA比值与MHCⅡa mRNA相对含量呈正相关关系，而与MHCⅡb mRNA之间存在负相关关系。故推测MyoD及myogenin从基因层面影响重链肌球蛋白mRNA的表达，即myogenin/MyoD mRNA比值越高，越能促进较慢收缩纤维的mRNA的表达。

因此，iOVD使青少年和年轻成年大鼠深层咬肌的重链肌球蛋白mRNA向MHCⅡa发生转化，青少年大鼠的深层咬肌MHCⅡa的mRNA相对表达量更多。生肌调节因子MyoD和myogenin在纤维类型转变中发挥着一定的作用。

[1] Wožniak K,Piatkowska D,Lipski M,et al. Surface electromyography in orthodontics-a literature review[J]. Med Sci Monit,2013,31(19):416-423.

[2] Maffei C,Garcia P,de Biase NG. Orthodontic intervention combined with myofunctional therapy increases electromyographic activity of masticatory muscles in patients with skeletal unilateral posterior crossbite[J]. Acta Odontol Scand,2014,72(4):298-303.

[3] Piancino MG,Vallelonga T,Debernardi C,et al. Deep bite: a case report with chewing pattern and electromyographic activity before and after therapy with function generating bite[J]. Eur J Paediatr Dent,2013,14(2):156-159.

[4] Farronato G,Giannini L,Galbiati G,et al. Orthodontic-surgical treatment: neuromuscular evalptionuation in open and deep skeletal bite patients[J]. Prog Orthod,2013,29(14):41.

[5] Buckingham M,Rigby PW. Gene regulatory networks and transcriptional mechanisms that control myogenesis[J]. Dev Cell,2014,28(3):225-238.

[6] Pacagnelli FL,Aguiar AF,Campos DH,et al. Training improves the oxidative phenotype of muscle during the transition from cardiac hypertrophy to heart failure without altering MyoD and myogenin[J]. Exp Physiol,2016,101(8):1075-1085.

[7] Wang W,Wang J,Lu HY,et al. The effects of increasing occlusal vertical dimension on the deep masseter of rat at different ages[J]. Arch Oral Biol,2017，74:12-20.

[8] Suga T,Kimura E,Morioka Y,et al. Muscle fiber type predominant promoter activity in lentiviral-mediated transgenic mouse[J]. PLos One,2011,6(3):e16908.

[9] Kamikawa Y,Ikeda S,Harad K. Passive repetitve stretching for a short duration within a week increases myogenic regulatory factors and myosin heavy chain mRNA in rats skeletal muscles[J]. Scientific World Journal,2013,2013:493656.

[10] 姜晓红，张桂荣，刘继辉，等.多用途弓在成人牙周炎深覆颌矫治中的临床应用[J].河北医科大学学报,2015,35(1):73-76.

[11] Biondi K,Lorusso P,Fastuca R,et al. Evaluation of masseter muscle in different vertical skeletal patterns in growing patients[J]. Eur J Paediatr Dent,2016,17(1):47-52.

[12] Korfage JA,Kwee KE,Everts V,et al. Myosin heavy chain expression can vary over the length of jaw and leg muscles[J]. Cells Tissues Organs,2016,201(2):130-137.

[13] Ferry A,Schuh M,Parlakian A,et al. Myofiber androgen receptor promotes maximal mechanical overload-induced muscle hypertrophy and fiber type transition in male mice[J]. Endocrinology,2014,155(12):4739-4748.

[14] Booth FW,Ruegsegger GN,Toedebusch RG,et al. Endurance exercise and the regulation of skeletal muscle metabolism[J]. Prog Mol Biol Trarsl Sci,2015,135:129-151.

[15] Papa EV,Dong X,Hassan M. Skeletal muscle function deficits in the elderly:current perspectives on resistance training[J]. J Nat Sci,2017,3(1).pii:e272.

[16] Milewska M,Grabiec K,Grzelkowska-Kowalczyk K. Interactions of proliferation and differentiation signaling pathways in myogenesis[J]. Postepy Hig Med Dosw,2014,68:516-526.

[17] Singh K,Dilworth FJ. Differential modulation of cell cycle progression distinguishes members of the myogenic regulatory factor family of transcription factors[J]. FEBS J,2013,280(17):3991-4003.

[18] Zanou N,Gailly P. Skeletal muscle hypertrophy and regeneration: interplay between the myogenic regulatory factors(MRFs) and insulin-like growth factors(IGFs) pathways[J]. Cell Mol Life Sci,2013,70(21):4117-4130.

[19] Wiberg R,Jonsson S,Novikova LN,et al. Investigation of the expression of myogenic transcription factors,microRNAs and muscle-specific E3 ubiquitin ligases in the medial gastrocnemius and soleus muscles following peripheral nerve injury[J]. PLoS One,2015,10(12):e0142699.

[20] Huang W,Liu X,Chen R,et al. Effects of mechanical stretch with variant frequencies on alignment and differentiation of multilayer myotubes cultured in vitro[J]. Zhongguo Xiu Fu Chong Jian Wai Ke Za Zhi,2012,26(6):735-742.

The effects of increasing occlusal vertical dimension on mRNA of myosin heavy chain and myogenic regulatory factors in the deep masseter of rat at different ages

WANG Wen1, LIU Chun-yan1, LU Hai-yan1,MA Wen-sheng1, HU Xiao-ying1, DONG Fu-sheng2*
(1.DepartmentofOrthodontics,CollegeofStomatology,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China; 2.DepartmentofOral&MaxillofacialSurgery,CollegeofStomatology,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China)

[Abstract]Objective To investigate the influence of increasing occlusal vertical dimension(iOVD) on mRNA of myosin heavy chain and myogenic regulatory factors in deep masseter of rat at different ages. Methods Forty-eight male Wistar rats were divided into two groups: teenage group(1.5 months,n=24) and young adult group(8 months,n=24). Then the two groups were randomly divided into control and experimental group(n=12). The experimental groups were iOVD by placing composite resin on molars. So there were four groups according to the age and experimental intervention, namely teenager control group, teenager experimental group, young adult control group and young adult experimental group. The mRNA of the MHC, MyoD and myogenin of deep masseter were observed on day 7 and day 14 after iOVD. Results On the 7th day of iOVD, the relative level of MHCⅡa mRNA in group TE was higher than that in group TC. Aslo MHCⅡa mRNA levels in group YAC and group YAE were lower than that in group TC and TE(P<0.05). On the 14th day of iOVD, the relative level of MHCⅡa mRNA in group TE and YAE was higher than that in group TC and YAC. MHCⅡa mRNA levels in group YAC and group YAE were lower than that in group TC and TE(P<0.05). The relative level of MHCⅡx mRNA in group TE and group YAE was lower than that in group TC and group YAC on the 7th and the 14th day of iOVD(P<0.05). On the 7th day of iOVD, the relative level of MHCⅡb mRNA in group TE was higher than that in group TC. Aslo MHCⅡb mRNA level in group YAC and group YAE were higher than that in group TC and TE(P<0.05). On the 14th day of iOVD, the relative level of MHCⅡb mRNA in group TE and YAE was higher than that in group TC and YAC. Aslo MHCⅡb mRNA level in group YAC and group YAE were lower than that in group TC and TE(P<0.05). On the 7th and the 14th day of iOVD, the relative level of MyoD mRNA in group TE and group YAE was higher than that in group TC and YAC. The relative level of MyoD mRNA in group TE and YAE was higher than that in group TC and YAC(P<0.05). The relative level of myogenin mRNA and myogenin:MyoD mRNA in group TE and group YAE was higher than that in group TC and group YAC, group YAC and group YAE was lower than group TC and group TE on the 7th and the 14th day of iOVD(P<0.05).There was positive correlation between the myogenin/MyoD mRNA ratio and MHC Ⅱa mRNA(r=0.954，P<0.05), and negative correlation between myogenin/MyoD mRNA ratio and MHC Ⅱb mRNA(r=-0.755，P<0.05). Conclusion The deep masseter of teenager rat in experimental group changes to MHC Ⅱa mRNA earlier and more than that of young adult rat. The MyoD and myogenin which belong to myogenic regulatory factors plays an important role in fiber reconstruction.

[作者简介]王雯(1985-)，女，天津人，河北医科大学口腔医院主治医师，医学博士，从事错牙合畸形的临床与基础研究。

咬合垂直距离升高对不同年龄大鼠深层咬肌重链肌球蛋白及肌源性调节因子mRNA表达的影响

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

2 结果

3 讨论