白细胞介素28B基因多态性与慢性HCV感染及抗HCV疗效的关系

孔令波，南月敏*，张玉果，赵素贤，王荣琦，邸海灵
(河北医科大学第三医院中西医结合肝病科，河北石家庄 050051)

[摘要]目的探讨白细胞介素28B(interleukin 28B，IL-28B)基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)与丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)慢性感染及抗病毒疗效的关系。方法选择河北省慢性丙型肝炎及代偿期丙型肝炎肝硬化患者253例，健康体检者83例作为对照组。TaqMan探针法检测IL-28B rs8099917位点SNPs，分析HCV感染患者与对照组IL-28B rs8099917位点等位基因及基因型分布差异，并探讨患者IL-28B rs8099917位点SNPs与抗HCV疗效的关系。结果患者IL-28B rs8099917位点G、T等位基因分布以及GG/GT、TT基因型分布与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。IL-28B rs8099917位点SNPs与患者基线HCV RNA水平及HCV 基因型均不相关(P>0.05)。获得完全早期病毒学应答(complete early virological response，cEVR)及持续病毒学应答(sustained virological response，SVR)的患者IL-28B rs8099917位点T等位基因、TT基因型携带率均显著高于未获得cEVR及SVR患者。结论河北省人群IL-28B rs8099917位点SNPs与HCV慢性感染易感性不相关，且与患者基线HCV RNA水平及感染HCV基因型不相关。携带TT基因型患者更易获得cEVR及SVR。

[关键词]丙型肝炎，慢性；白细胞介素28B；多态性，单核苷酸

人类基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)与多种疾病发生有关[1-2]，近年来其与丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)慢性感染以及抗HCV疗效的关系成为研究热点[3-7]。白细胞介素28B(interleukin 28B，IL-28B)基因位于人19号染色体，编码干扰素λ(interferon λ，IFNλ)3，IFNλ3可促进HCV感染后自发性及IFNα诱导的病毒清除[8]。关于中国人群IL-28B rs8099917位点SNPs与HCV慢性感染及病毒学应答的研究较少，尤其在河北省人群中鲜见报道。本研究旨在对比IL-28B rs8099917位点等位基因及基因型分布在河北省慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C，CHC)及代偿期丙型肝炎肝硬化患者与健康对照人群间的差异，探讨IL-28B rs8099917位点SNPs与HCV易感性的关系，并进一步分析其在病毒学应答中的预测价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2010年11月—2012年10月河北医科大学第三医院、石家庄市第五医院、中国人民解放军白求恩国际和平医院、沧州市传染病医院、邯郸市传染病医院、河北医科大学第一医院、邢台市人民医院收治的CHC及代偿期丙型肝炎肝硬化患者253例，男性123例，女性130例，年龄18～75岁，中位年龄46岁。血清抗-HCV阳性，HCV RNA ≥ 15 U/mL，ALT和(或)AST持续升高6个月以上。排除标准：发生失代偿期肝硬化或原发性肝癌；合并其他嗜肝病毒感染；HIV感染；自身免疫性或遗传性肝病；严重心脑血管、自身免疫系统、血液系统及神经系统疾病；妊娠及哺乳期妇女。同期选择83例健康体检者作为对照组，男性39例，女性44例，年龄18～75岁，中位年龄42岁。2组性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2 治疗方案采用IFN联合利巴韦林抗病毒治疗方案，根据患者基线特征及经济能力制定个体化治疗方案。普通IFNα-2b(购自北京凯因科技发展有限公司)组：IFNα-2b 100～300 MU(年龄>65～75岁、体质量<60 kg、代偿期肝硬化、中性粒细胞减少)或500 MU(年龄18～65岁，体质量≥60 kg)，1次/隔日，皮下注射。聚乙二醇IFNα(pegylated interferon alpha，PegIFNα)-2a(购自上海罗氏制药有限公司)组：PegIFNα-2a 67.5～135 μg(年龄>65～75岁、体质量<60 kg、代偿期肝硬化、中性粒细胞减少)或180 μg(年龄18～65岁，体质量≥60kg)，1次/周，皮下注射。PegIFNα-2b(购自美国先灵葆雅公司)组：1.5 μg/kg，1次/周，皮下注射。根据患者体质量及血红蛋白水平确定利巴韦林剂量，900～1 200 mg/d。个体化治疗疗程根据病毒学应答反应制定，HCV RNA水平降至检测下限之后继续治疗44周。治疗结束之后随访24周。治疗过程中，若出现中性粒细胞显著下降(<0.5×109/L)、严重贫血(血红蛋白<60 g/L)、严重甲状腺功能亢进或减退、精神疾病、严重皮疹等严重不良反应，或出现肝硬化、肝癌等，需停药。

1.3 疗效判断参照《丙型肝炎防治指南(2015年更新版)》[9]定义病毒学应答情况。完全早期病毒学应答(complete early virological response，cEVR)：治疗12周时HCV RNA水平检测不到。持续病毒学应答(sustained virological response，SVR)：治疗结束并随访24周HCV RNA水平检测不到。无应答(non-response，NR)：治疗12周时HCV RNA水平下降<2Log U/mL。NR还包括治疗及随访过程中病毒学突破及反弹者。

1.4 生化学检测血清ALT及AST水平应用OLYMPUS AU5400全自动生物化学分析仪(购自日本OLYMPUS公司)检测。

1.5 血清抗-HCV、HCV RNA及HCV基因型检测应用酶联免疫吸附测定试剂盒[购自英科新创(厦门)科技有限公司]测定血清抗-HCV；应用COBAS TaqMan系统[购自美国罗氏诊断产品(上海)有限公司]检测血清HCV RNA；HCV基因分型，采用HCV基因分型芯片技术(天津市第三中心医院)。

1.6 IL-28B rs8099917位点SNPs检测应用TaqMan检测系统(购自美国Applied Biosystems公司)分析。IL-28B rs8099917位点TaqMan探针序列：VIC-TTTGTTTT CCTTTCTGTGAGCAA-T[G]TCACCCAAATTGGAACCATGCTGTA-MGBNFQ，FAM-TTTGTTTTCCTTTCTGTGA-GCAAT[T]TCACCCAAATTGGAACCATGCT GTA-MGBNFQ。应用ABI 7500实时定量PCR仪(购自美国Applied Biosystems公司)对DNA样品进行扩增，PCR反应条件：95 ℃ 10 min，92 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40个循环。

1.7 统计学方法应用SPSS 13.0统计学软件处理数据。计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组IL-28B rs8099917位点多态性分布比较患者组与对照组IL-28B rs8099917位点上的G、T等位基因与GG/GT、TT基因型分布差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 慢性HCV感染患者与对照组IL-28B rs8099917位点多态性分布比较
Table 1 Comparison of IL-28B rs8099917 polymorphisms between chronic HCV infected patients and healthy controls (例数，%)

2.2 不同基线HCV RNA水平患者IL-28B rs8099917位点等位基因及基因型分布比较低HCV RNA水平患者与高HCV RNA水平患者IL-28B rs8099917位点上的G、T等位基因和GG/GT和TT基因型分布差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 不同基线HCV RNA水平患者IL-28B rs8099917位点多态性分布比较
Table 2 Comparison of IL-28B rs8099917 polymorphisms between patients with different baseline HCV RNA levels (例数，%)

2.3 不同HCV基因型患者IL-28B rs8099917位点等位基因及基因型分布比较 118例患者检测了HCV基因型，结果显示1型85例，2型31例，1型、2型混合型3例，3型1例，4型1例。HCV基因1型及2、3、4型感染患者之间IL-28B rs8099917位点等G、T位基因分布以及GG/GT及TT基因型分布差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 不同HCV基因型患者IL-28B rs8099917位点多态性分布比较
Table 3 Comparison of IL-28B rs8099917 polymorphisms between patients with different HCV genotypes (例数，%)

2.4 获得与未获得cEVR患者IL-28B rs8099917位点等位基因及基因型分布比较治疗12周，cEVR率为83.64%(179/214)。获得cEVR的患者IL-28B rs8099917位点T等位基因、TT基因型携带率均显著高于未获得cEVR患者(P<0.05)，见表4。

2.5 获得SVR患者与NR患者IL-28B rs8099917位点等位基因及基因型分布比较完成治疗及随访时，SVR率为68.22%(146/214)。获得SVR患者IL-28B rs8099917位点T等位基因、TT基因型携带率均显著高于NR患者(P<0.01)，见表5。

表4 获得与未获得cEVR患者IL-28B rs8099917位点多态性分布的比较
Table 4 Comparison of IL-28B rs8099917 polymorphisms between patients achieved cEVR and those didn't achieve cEVR (例数，%)

表5 获得SVR患者与NR患者IL-28B rs8099917位点多态性分布比较
Table 5 Comparison of IL-28B rs8099917 polymorphisms between patients achieved SVR and NR patients (例数，%)

3 讨论

既往国外多项研究发现IL-28B多个位点SNPs能够预测HCV自然清除和抗病毒治疗应答。然而，人基因多态性受地域及环境影响，不同地域、不同种族人群IL-28B SNPs与HCV感染及临床转归的关系各异[5-6, 10-11]。本研究采用TaqMan探针实时荧光PCR方法检测河北省人群IL-28B rs8099917位点SNPs，并分析其与HCV慢性感染及临床抗病毒疗效的关系，以探寻该人群HCV慢性感染易感因素及抗HCV治疗病毒学应答预测因素。

本研究结果显示，CHC及丙型肝炎肝硬化患者IL-28B rs8099917位点G、T等位基因分布以及GG/GT、TT基因型分布与对照组比较差异无统计学意义，提示河北省人群IL-28B rs8099917位点SNPs与HCV感染易感性不相关。另外，本研究进一步分析了IL-28B rs8099917位点G、T等位基因及GG/GT、TT基因型在高HCV RNA水平与低HCV RNA患者水平之间以及不同HCV基因型患者之间的分布差异，结果显示IL-28B rs8099917位点SNPs与HCV RNA水平及HCV基因型均不相关。

目前，直接作用抗病毒药物还未在我国上市，IFN联合利巴韦林仍是我国抗HCV的主要治疗方案[9]。本研究还分析了IL-28B rs8099917位点多态性与病毒学应答的关系，结果显示T等位基因、TT基因型携带者更易获得cEVR及SVR。其机制可能为IL-28B rs8099917位点SNPs影响IFNλ3表达或蛋白结构，使抗病毒应答能力发生变化。有研究发现IL-28B rs8099917位点SNPs与IFNλ3表达水平相关，T等位基因携带者IFNλ3高表达[11-12]。病毒或双链RNA激活外周血单核细胞、树突状细胞等，使之产生IFNλ3[13]，IFNλ3与受体结合后启动下游信号级联反应，激活JAK-STAT信号通路，形成IFN激活基因因子3，进入细胞核内与IFN激活反应元件相互作用，上调IFN刺激基因表达[14]。IFN刺激基因数目众多，其中包括2′-5′寡聚腺苷酸合成酶及抗黏病毒因子1等，2′-5′寡聚腺苷酸合成酶可激活内源性核糖核酸酶L，使病毒单链RNA降解，而抗黏病毒因子1则可减弱细胞内病毒的运输，阻碍病毒复制，从而发挥抗病毒作用。因此，推测IL-28B rs8099917位点SNPs可能通过调控IFNλ3表达水平，影响机体的抗病毒能力，TT基因型携带者IFNλ3表达水平较高，故抗病毒能力较强，更易获得良好的疗效。

综上所述，河北省人群中IL-28B rs8099917位点SNPs与HCV慢性感染不相关。IL-28B rs8099917位点SNPs可作为抗病毒疗效的预测因素，TT基因型携带者抗病毒疗效较好。

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Association between interleukin 28B gene polymorphisms and chronic hepatitis C virus infection and response to anti-HCV treatment

KONG Ling-bo, NAN Yue-min*, ZHANG Yu-guo, ZHAO Su-xian, WANG Rong-qi, DI Hai-ling
(DepartmentofTraditionalandWesternMedicalHepatology,theThirdHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050051,China)

[Abstract]Objective To explore the association of interleukin 28B(IL-28B) single nucleotide polymorphisms(SNPs) with chronic hepatitis C virus(HCV) infection and response to anti-HCV treatment. Methods Two hundred and fifty-three patients with chronic hepatitis C and compensated cirrhosis, and 83 healthy controls were genotyped for the IL-28B rs8099917 polymorphisms by TaqMan system. The relation of IL-28B rs8099917 SNPs and chronic HCV infection, and the association of IL-28B rs8099917 SNPs and virological responses were analyzed. Chi-square test was performed for comparison of categorical data. Results The patients with chronic HCV infection and the healthy controls showed similar frequencies of G, T allele and GG/GT, TT genotypes(P>0.05). IL-28B rs8099917 SNPs were neither significantly associated with baseline HCV RNA level nor with HCV genotype(P>0.05). The presences of IL-28B rs8099917 T allele and TT genotype were significantly higher in patients achieved early virological response and sustained virological response than non-response patients. Conclusion In Hebei province, polymorphisms in IL-28B rs8099917 were not associated with susceptibility to chronic HCV infection. IL-28B rs8099917 T allele and TT genotype were predictors for better virological responses.

[Key words]hepatitis C virus， chronic; interleukin-28B; polymorphism, single nucleotide

[作者简介]孔令波(1981-)，女，河北临漳人，河北医科大学第三医院主治医师，医学博士，从事慢性肝病诊治研究。

白细胞介素28B基因多态性与慢性HCV感染及抗HCV疗效的关系

1 资料与方法

2 结 果

3 讨 论

2 结果

3 讨论