Table 1 Comparison on the levels of T4，T3and TSH in three groups
·论 著·
姜彦峰1，陈安志2*，胡辽辽3，齐学林4
(1.陕西省咸阳市中心医院检验科，陕西 咸阳 712000；2.陕西省石泉县中医医院检验科，陕西 石泉 725200；3.西安交通大学第一附属医院检验科，陕西 西安 710061；4.陕西省咸阳市中心医院内分泌科，陕西 咸阳 712000)
[摘要]目的探讨血清miRNA-206,-155检测在预测甲状腺功能亢进(甲亢)停药后复发中的临床应用价值。方法选择甲亢患者142例，分为未治疗组45例，复发组41例和未复发组56例，采用实时逆转录-聚合酶链反应技术检测各组miRNA-206、miRNA-155表达水平。采用电化学发光技术检测各组血清三碘甲状原氨酸(triiodothyronine，T3)、甲状腺素(tyroxine，T4)和促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)水平。通过彩色多普勒超声检测甲状腺上动脉(superior thyroid artery,STA)内径(diameter，D)和收缩期最高血流速度(peak systolic velocity，Vmax)。结果未治疗组和复发组血清T4、T3、STA-D和Vmax水平高于未复发组，TSH水平低于未复发组(P<0.05)；未治疗组与复发组间T4、 T3、TSH、STA-D和Vmax水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。未治疗组和复发组miRNA-155表达水平高于未复发组，miRNA-206表达水平低于未复发组(P<0.05),未治疗组与复发组miRNA-155，-206表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。复发组中miRNA-206表达与miRNA-155表达呈负相关(r=-0.692,P<0.01)，miRNA-206表达与T4、T3、STA-D和Vmax水平呈负相关(r=-0.562、-0.593、 -0.537,-0.519，P<0.01)，与TSH呈正相关(r=0.622,P<0.01)；miRNA-155表达与血清T4、 T3、STA-D和Vmax水平呈正相关(r=0.530、0.562、0.553、0.503,P<0.01)，与TSH呈负相关(r=-0.689,P<0.01)。miRNA-206和miRNA-155在最佳临界值处诊断甲亢复发的敏感度和特异度分别为93.2%和90.7%、91.6%和97.2%。结论血清miRNA-206,-155检测可应用于甲亢停药后复发的预测，并可能成为甲亢治疗有效的预警标志物和干预靶点。
[关键词]甲状腺功能亢进症；复发；微RNAs
目前对甲状腺功能亢进(甲亢)的治疗主要有抗甲状腺药物治疗、放射性131I治疗及手术切除3种方式。药物治疗的特点是安全有效，经济方便，不易导致甲状腺功能减低，故药物治疗甲亢成为临床上的首选，但甲亢治疗停药后的复发率较高[1]。因此，及时、正确地预测及监测甲亢的复发有助于减少患者的风险及医疗费用。微小核糖核酸(microbonucleic acids，miRNAs)是一类内源性非编码小分子RNA，已被证实有多个miRNAs在甲亢的发生中发挥作用[2]。毒性弥漫性甲状腺肿(Graves病)是引起甲亢的最常见原因，是一种炎症性自身免疫性疾病，其病理特征是由CD4+T细胞和眼肌成纤维细胞引起的炎症和纤维组织增生[3]。研究表明miRNAs在炎症和纤维组织增生的病理过程中起着重要作用[3]。本研究通过实时逆转录-聚合酶链反应技术检测甲亢患者血清miRNA-206，-155的表达，探讨其在甲亢发生中可能的作用机制，旨在寻找停药后甲亢复发有效的预警标志物和干预靶点。现报告如下。
1.1 一般资料 选择2014年5月—2016年5月于西安交通大学第一附属医院、咸阳市中心医院及陕西省石泉县中医医院内分泌科门诊就诊或住院治疗的甲亢患者142例。甲亢患者的临床表现为心悸、出汗、怕热、纳亢、消瘦、手细颤等。所有病例均符合甲亢的诊断标准：高代谢症状及体征；甲状腺呈弥漫性肿大；血清三碘甲状腺原氨酸(triiodothyronine，T3)、甲状腺素(tyroxine，T4)增高，促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)减低；伴浸润性突眼。排除甲状腺腺瘤、甲状腺癌伴甲亢、结核及恶性肿瘤等疾病。将甲亢患者分为3组:未治疗组45例，男性13例，女性32例，年龄22～63岁，平均(35.8±11.3)岁；复发组41例，男性12例，女性29例，年龄24～66岁，平均(36.2±11.7)岁；未复发组56例，男性16例，女性40例，年龄23～66岁，平均(36.7±10.5)岁。所有甲亢患者中Graves病93例。各组性别和年龄比较差异均无统计学意义(P>0.05)。
本研究经医院伦理委员会批准，所有研究对象知情同意并签署知情同意书。
1.2 治疗方法 甲亢患者使用抗甲状腺药物治疗。①治疗期：口服他巴唑10～20 mg,1次/d；每4周复查血清甲状腺激素水平。②维持期：血清甲状腺激素正常后减量，维持量口服他巴唑5～10 mg,1次/d；维持时间为12～18个月；每2个月复查血清甲状腺激素水平。复发组患者停药1年后T3、T4水平升高，TSH降低。复发时患者出现不同程度的甲亢症状，未治疗组甲亢患者均未服用抗甲亢药物。未复发组患者停药1年，血清TSH和T3、T4水平正常。
1.3 彩色超声检查 应用Philip公司 HDI5000-5彩色多普勒血流显像仪,采用高频探头，先利用二维超声观察甲状腺腺体,然后加彩色超声,观察腺体血流信号的分布和形态。在甲状腺右叶上极找到甲状腺上动脉(superior thyroid artery,STA),用测径仪测量其内径(diameter，D),并测定右STA的收缩期最高血流速度(peak systolic velocity，Vmax),取样容积1～2 mm,声速与血流夹角控制在0～60 °。
1.4 标本采集 未治疗组患者于未用药前采集空腹静脉血4 mL，复发组和未复发组患者于停药后12个月采集空腹肘静脉血4 mL，3 000 r/min，离心15 min，吸上清液至冻存管中，-80 ℃保存。
1.5 研究方法 采用实时逆转录-聚合酶链反应技术检测甲亢患者血清miRNA-206，-155表达水平。采用电化学发光技术检测血清T3，T4和TSH水平。RNA提取使用美国Invitrogen公司产品。应用德国Roche公司lightCycler荧光PCR仪和电化学发光分析仪。
1.5.1 RNA提取 采用Trizol法提取血清中的RNA，并在分光光度计上检测其在波长260、280 nm处的吸光度比值以验证RNA的纯度。若比值在1.7～2.0间则考虑总RNA 溶液无杂质。
1.5.2 PCR扩增 采用pfimer 5软件设计引物。miRNA-206的引物序列为：正义链5′-AGCGGCAGAATCAGGAGTA-3′,反义链 5′- GAGGACCTTGGAGGCAGAC - 3′； 产物长度660 bp。miRNA-155的引物序列为：正义链5′-TTAATGCTAATCGTGA-3′,反义链 5′-ACCTGAGAGTAGACCAGA-3′,产物长度 630 bp。以β-actin作为内参照，引物序列为：正义链5′-ATGTCACGCACGATTTCC-3′,反义链5′-CTGTCCCTGTATGCCTCTG-3′，产物长度360 bp。反应条件：94 ℃ 3 min→94 ℃ 60 s,60 ℃ 30 s,70 ℃ 1.5 min，40个循环→70 ℃ 15 min→4 ℃保存。
1.5.3 基因片段序列分析 PCR产物使用测序仪进行序列测定。测序结果应用BLAST应用软件和GenBank中的已知序列进行同源性比较。
1.5.4 miRNAs相对表达量检测 对扩增的目的片段进行凝胶电泳，并进行扫描记录和处理，得出mRNA的吸光度(Ct值)，miRNAs表达量用Ct值的变化(△Ct)表示。△Ct=(Xn)Ct-(β-actin)Ct，(β-actin)Ct是内参照的Ct值，Xn表示甲亢患者的Ct值。由2-△ct得出相应的miRNAs的相对表达量。
1.6 统计学方法 应用SPSS 21.0统计软件分析数据。计量资料比较分别采用单因素方差分析和SNK-q检验；相关性采用Pearson相关分析。建立受试者工作特征曲线(ROC曲线)评价 miRNA-206、miRNA-155在甲亢患者停药后复发监测中的作用。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 3组T4、 T3、TSH水平比较 未治疗组和复发组血清T4、 T3水平高于未复发组，TSH水平低于未复发组比较,差异有统计学意义(P<0.05)；未治疗组与复发组间T4、 T3和TSH水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。
表1 3组血清T4、T3、TSH水平比较
Table 1 Comparison on the levels of T4，T3and TSH in three groups
*P<0.05与未复发组比较(SNK-q检验)
2.2 3组STA-D、Vmax比较 未治疗组、复发组STA-D和Vmax高于未复发组，差异有统计学意义(P<0.05)；未治疗组与复发组STA-D、Vmax比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。
表2 3组STA-D、Vmax比较
Table 2 Comparison on STA-D and Vmax in three groups
*P<0.05与未复发组比较(SNK-q检验)
2.3 3组miRNA-206,-155表达水平比较 未治疗组和复发组miRNA-155表达水平高于未复发组，miRNA-206表达水平低于未复发组，差异有统计学意义(P<0.05)；未治疗组与复发组miRNA-155，-206表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。
表3 3组血清miRNA-206、-155表达水平比较
Table 3 Comparison on the levels of serum miRNA-206，-155 in three groups
*P<0.05与未复发组比较(q检验)
2.4 相关性分析 复发组中miRNA-206表达与miRNA-155表达呈负相关(r=-0.692,P<0.01)，miRNA-206表达与血清T4、T3、STA-D和Vmax水平呈负相关(r=-0.562、-0.593、 -0.537、-0.519，P<0.01)，与TSH呈正相关(r=0.622,P<0.01)；miRNA-155表达与血清T4、 T3、STA-D和Vmax水平呈正相关(r=0.530、0.562、0.553、0.503,P<0.01)，与TSH呈负相关(r=-0.689,P<0.01)。
2.5 ROC曲线分析 以复发组和未复发组为因变量分析显示，血清miRNA-206和miRNA-155的曲线下面积分别为0.731(95%CI=0.618～0.845，P=0.001)、0.741(95%CI=0.629～0.853，P=0.000)(图1)，以复发组和未治疗组为因变量分析显示，血清miRNA-206和miRNA-155的曲线下面积分别为0.543(95%CI=0.408～0.677，P=0.531)、0.584(95%CI=0.447～0.721，P=0.216) (图2)。miRNA-206和miRNA-155在最佳临界值处诊断甲亢复发的敏感度和特异度分别为93.2%和90.7%、91.6%和97.2%。表明血清miR-206和miR-155水平在甲亢复发的诊断中有临床意义。
图1 miRNA-155在诊断甲亢复发中的ROC曲线
Figure 1 The ROC curve of miRNA-155 in diagnosis of hyperthyroidism relapse
图2 miRNA-206在诊断甲亢复发中的ROC曲线
Figure 2 The ROC curve of miRNA-206 in diagnosis of hyperthyroidism relapse
miRNA在调控基因的表达中扮演着的重要的角色[4]。已有大量实验证实，miRNAs作为重要的免疫调控分子，通过调控miRNA的翻译，引起蛋白质的表达改变，从而影响生物效应[5]。在文献报道的9 000多个 miRNAs中，其中人源miRNAs 基因近700个[6]。miR-155 是人源miRNAs的一种，位于人类 21 号染色体 B-cell Integration Cluster基因的第3个外显子内，该基因不含开放阅读框，其过量的表达可能促进组织的炎性反应及细胞的异常增殖[7]。Li等[3]研究发现miR-155通过增强炎症性T细胞的活性促进自身免疫性炎症的发展，影响细胞增生。推测miR-155可能是一种促炎性物质，这可在沉默miR-155的小鼠实验中被证实，该实验的结果显示沉默miR-155后小鼠心肌组织的促炎因子干扰素γ水平显著降低,而抗炎因子白细胞介素4和白细胞介素13水平显著增加[8]。研究表明miR-155的异常表达可存在于系统性硬化病[9]、类风湿性关节炎[10]及系统性红斑狼疮[11]等多种自身免疫性疾病中。Graves病是一种炎症性自身免疫性疾病，过度表达的miR-155促进Graves病的病变发展，其作用机制为在Graves病的患者甲状腺内存在T细胞的浸润，其损伤甲状腺腺体，刺激机体产生抗甲状腺过氧化酶抗体。这些抗体活化甲状腺，导致过量的甲状腺激素的产生。miR-155能够促进 T细胞的分化调节人体免疫，参与机体免疫应答[12-13]。提示miR-155的表达可能参与了甲亢疾病的病变进展。本研究结果显示，未治疗组和复发组miR-155表达显著高于未复发组，未治疗组与复发组间差异无统计学意义。进一步揭示miRNA-155的表达能反映甲亢复发时miRNAs的调控状况和代谢水平，成为甲亢缓解和维持的关键miRNA，有望成为甲亢治疗后复发的早期预警标志物及甲亢治疗的新靶点。miRNA-155 在甲亢中的具体作用机制，有待实验进一步阐明。相信随着研究的不断深入，推测其可能成为更多疾病的诊断、治疗和预后评价的重要检测指标，并为临床提供更加简便、可靠的诊断标准。
甲状腺激素在某些生物学过程中发挥着调节作用。有研究认为T3通过作用靶基因里的甲状腺激素反应元影响细胞的增殖过程，某些miRNAs可能参与该过程[14-15]。甲状腺激素与miRNA-206表达存在一定的关系。邢倩等[15]采用Affymetrix基因芯片分析miRNAs表达谱，结果显示甲状腺功能减退与正常的Wistar母鼠及后代脑组织存在差异性表达的miRNAs，其中miRNA-206表达增高2倍以上。Dong等[16]采用甲巯基咪唑(抗甲状腺药物)短期暴露于幼稚小鼠建立甲状腺功能减低小鼠模型，分析甲状腺激素的变化与miRNAs表达的关系，结果显示小鼠肝脏组织AML 12 cells中miRNA-206的表达水平呈现上调。以上研究表明miRNA-206的表达受到体内甲状腺激素变化的影响，miRNA-206的低表达与甲状腺激素水平增高有关。本研究结果显示复发组miRNA-206表达水平显著低于未复发组，提示miRNA-206水平可能为甲亢复发的预测诊断提供参考依据；未治疗组miRNA-206表达与未复发组比较显著降低，提示miRNA-206可能参与甲亢患者体内甲状腺激素的调控。推测甲亢患者经过该标志物的调控可能使血清甲状腺激素的水平得到纠正，甲亢症状进一步缓解。人类miRNAs作为一种新发现的小分子调控物质，其丰富的功能拓宽了人们对转录后基因表达调控机制的理解。miRNA-206作为临床上一种新手段检测甲亢复发，还可能为更多的疾病治疗提供依据，如杜氏肌营养不良、肌萎缩侧索硬化症等，这些才是将来研究的焦点。
本研究结果显示，复发组中miRNA-206与miRNA-155表达呈负相关；miRNA-206表达与血清T4、T3、STA-D和Vmax水平呈负相关，与TSH呈正相关；miRNA-155表达与血清T4、T3、STA-D和Vmax水平呈正相关，与TSH呈负相关。提示miRNA-206，-155与甲亢的发生发展密切相关。其变化可以反映甲亢治疗后患者症状的改善状况。利用ROC曲线的分析结果显示，血清miRNA-206和miRNA-155水平对甲亢患者停药后复发的监测有诊断意义(P<0.01)。
综上所述，血清miRNA-206和miRNA-155的检测可应用于甲亢患者停药后复发的预测，并可能为甲亢的治疗提供有效的基因学依据。
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(本文编辑：赵丽洁)
The application of detecting serum miRNA-206, -155 in hyperthyroidism relapse after relieving
JIANG Yan-feng1， CHEN An-zhi2*， HU Liao-liao3， QI Xue-lin4
(1.DepartmentofLaboratory,theCentralHospitalofXianyangCity,ShaanxiProvince，Xianyang712000，China; 2.DepartmentofLaboratory,theHospitalofChineseTraditionalMedicineofShiquanCountry,ShaanxiProvince，Shiquan725200，China; 3.DepartmentofLaboratory,theFirstAffiliatedHospitalofXi′AnJiaotongUniversity,Xi′an710061，China； 4.DepartmentofEndocrinology，theCentralHospitalofXianyangCity,ShaanxiProvince，Xianyang712000，China)
[Abstract]Objective To investigate the clinical application value of detecting serum microRNA-206， -155 in predicting hyperthyroidism relapse after drug withdrawal. Methods The expression levels of serum microRNA-206，-155 in 142 patients with hyperthyroidism were detected by technology(45 cases in the non-treatment group, 41 cases in the relapse group and 56 cases in the non-relapse group) in detecting serum T3, T4and TSH levels by the electrochemical luminescence technology. The inner diameter(diameter, D) and the maximum systolic blood flow velocity(peak systolic velocity, Vmax) of the superior thyroid artery(superior thyroid, STA) were examined by color Doppler ultrasonography. Results In the relapse group and the non-treatment group, the levels of T4,T3, STA-D and Vmax were higher than those in the non-relapse group, respectively, but TSH were lower(P<0.05). The levels of T4, T3, TSH, STA-D and Vmax between the relapse group and the non-treatment group were compared, but without statistically significant difference(P>0.05). The expression of miRNA-206 was negatively correlated with the expression of miRNA-155(r=-0.692,P<0.01). MiRNA-206 expression was negatively correlated with T4, T3, STA-D and Vmax(r=-0.562, -0.593, -0.537, -0.519,P<0.01) and positively correlated with TSH(r=0.622,P<0.01). The expression of miRNA-155 was positively correlated with serum T4, T3, STA-D and Vmax(r=0.530, 0.562, 0.553, 0.503,P<0.01), and negatively correlated with TSH(r=-0.689,P<0.01). The sensitivity and specificity of miRNA-206 and miRNA-155 in the diagnosis of hyperthyroidism at the best critical value were 93.2% and 90.7%, 91.6% and 97.2%, respectively. Conclusion The detection of serum microRNA-206, -155 can be used in prediction of hyperthyroidism relapse after discontinuation of medicine treating, and may be an useful warning markers and intervention targets for hyperthyroidism treating.
[Key words]hyperthyroidism; recurrence; microRNAs
[收稿日期]2016-07-23；
[修回日期]2017-03-04
[作者简介]姜彦峰(1974-)，男，陕西礼泉人，陕西省咸阳市中心医院主管检验师，医学学士，从事临床检验学研究。
*通讯作者。E-mail：3248089878@qq.com
[中图分类号]R581.1
[文献标志码]A
[文章编号]1007-3205(2017)07-0814-05
doi：10.3969/j.issn.1007-3205.2017.07.017