·论著·
赵红伟1，张 建1，和丽丽2，李月芹1，朱叶珊3，刘建平4*
(1.河北省人民医院消化一科，河北 石家庄 050051； 2.河北省人民医院老年病科，河北 石家庄 050051；3.河北省唐山市中医院脾胃科，河北 唐山 063000；4. 河北省中医院脾胃科，河北 石家庄 050011)
[摘要]目的探讨银杏叶提取物(extract of ginkgo biloba,EGB 761)对肠炎模型小鼠免疫机制调节作用。方法将30只小鼠随机分为正常组、模型组、EGB 761组，建立动物模型；观察小鼠疾病活动指数(disease activity index,DAI)、结肠大体评分、结肠病理学变化、流式细胞术检测T淋巴细胞亚群(CD3+、CD4+、CD8+)变化、免疫比浊法检测血清免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM)变化、免疫组织化学染色测定结肠组织细胞间黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule 1，ICAM-1)变化。结果EGB 761干预后小鼠DAI下降明显，结肠黏膜炎症程度较模型组明显减轻；同时能明显降低模型小鼠血清中CD3+、CD4+含量，升高CD8+含量，降低IgA、IgG、IgM含量，减少结肠组织黏膜中ICAM-1阳性细胞染色。结论EGB 761对肠炎模型小鼠具有免疫调节作用。
[关键词]结肠炎，溃疡性；免疫机制；小鼠
溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)是一种原因不明的肠道炎症性疾病，目前的流行病学资料显示，其发病率在国内外有逐年上升的趋势，UC反复发作，严重影响患者的正常工作和生活[1-2]。研究表明UC的发病机制与免疫异常关系密切，故针对免疫机制进行调节，可为UC的治疗提供新的方向。银杏叶提取物(extract of ginkgo biloba，EGB 761)的活性成分是萜烯部分，其中包括白果内酯及银杏内酯，对免疫功能有较大的调节作用。本研究通过对急性期UC模型小鼠的EGB 761干预，探讨EGB 761在UC免疫机制方面的调节作用。
1.1 试剂与动物 右旋葡聚糖硫酸钠(美国Sigma公司；EGB 761(金钠多注射液,德国威玛舒培药厂)；免疫球蛋白IgA、IgG、IgM (四川迈克科技有限责任公司)；细胞间黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule 1，ICAM-1)(北京博奥森生物技术有限公司)；CD3+、CD4+、CD8+抗体(美国Beckmen Coulter公司)；磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)；C57BL/6小鼠(体质量19～21 g，年龄8～11周)，购于北京维通利华实验动物技术有限公司。
1.2 动物模型建立及干预方法 按随机数字表随机将30只雄性C57BL/6小鼠分为正常组(10只)、模型组(10只)和EGB 761组(10只)。正常组小鼠从实验第1天开始自由饮用蒸馏水至第7天，同时给予PBS 1 mL(200 mg/kg)灌肠从第1～7天。模型组小鼠从第1天起自由饮用2% DSS 至第7天，同时给予PBS 1 mL(200 mg/kg)灌肠从第1～7天。EGB 761组小鼠自实验开始第1天起自由饮用2% DSS至第7天，同时给予银杏叶提取物1 mL(200 mg/kg)灌肠从第1～7天。第8天处死所有动物[3]。
1.3 小鼠一般情况和疾病活动指数(disease activity index，DAI)以及结肠组织大体评分 每天观察小鼠的精神状态、毛发光泽度、食欲、体质量、粪便性状和有无潜血等。DAI评分标准、临床表现和病理大体评分标准见表1。
1.4 标本制作 在实验结束时处死小鼠，蜡包埋的结肠组织分别进行5 μm连续切片，按以下步骤进行染色：二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，自来水冲洗1 min，苏木精染色7 min，自来水冲洗2 min，1%盐酸酒精2 s，自来水冲洗2 min，1%氨水30 s，自来水冲洗4 min，0.5%伊红酒精30 s，酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察肠组织的组织病理学改变。
表1 DAI评分标准、临床表现和结肠组织大体评分
注：DAI评分=(体质量下降分数+粪便性状分数+便血分数)/3
1.5 检测T细胞亚群及免疫球蛋白变化 经腹腔麻醉小鼠，在动物解剖台上固定，剖开腹部，各组小鼠腹主动脉取血用乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA抗凝)后，取专用试管3支，分别加入CD3 FITC/CD4 PE、CD3 FITC/CD8 PE及其同型对照各10 μL，立刻加抗凝血100 μL，充分混匀后，室温下避光放置30 min。每管加红细胞裂解液2～3 mL，充分混匀，避光放置，至液体透亮。1 000 r/min离心5 min，去上清液。上机检测，流式细胞仪计数。检测前常规对流式细胞仪进行质量监控和双色荧光补偿，使其均在允许范围内。免疫比浊法检测血清免疫球蛋白IgA、IgG、IgM人血清或血浆中免疫球蛋白IgG、IgA和IgM与其相应抗体(羊抗人免疫球蛋白IgG、IgA和IgM血清)在液相中相遇，立即形成抗原-抗体复合物，并形成一定浊度。与通过同样处理的校准血清比较，即可计算出样品中免疫球蛋白IgG、IgA和IgM含量。
1.6 结肠组织免疫组织化学染色 新鲜肠组织以5 μm的厚度进行连续冰冻切片，按以下步骤进行一抗ICAM-1的免疫组织化学染色：4%多聚甲醛固定10 min，免疫染色洗涤液洗5 min 3次，封闭液封闭，4 ℃过夜免疫染色洗涤液洗5 min 3次，二抗37 ℃孵育30 min，洗涤液洗5 min 3次，光镜下观察结肠组织ICAM-1蛋白的表达情况，阴性对照组用PBS替代一抗，其余步骤同上。
1.7 统计学方法 应用SPSS 13.0软件进行统计分析，计量资料数比较分别采用单因素方差分析和SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 3组DAI评分比较 与正常组比较，模型组从第4天开始DAI评分逐渐升高，EGB 761组在第4天DAI评分已经下降为0，第5～8天DAI评分也较模型组明显降低，但仍高于正常组，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。
表2 3组DAI评分比较
分)
*P<0.01与正常组比较 #P<0.01与模型组比较(SNK-q检验)
2.2 3组结肠大体评分比较 与正常组比较，模型组结肠大体评分明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；EGB761组结肠组织大体评分低于模型组，但仍高于对照组，差异有统计学有意义(P<0.01)。见表3。
2.3 3组结肠组织病理学表现比较 与正常组比较，模型组小鼠结肠黏膜缺损，炎症细胞广泛浸润，隐窝增生；而EGB 761组结肠病理炎症浸润、病变深度、隐窝破坏均与模型组比较有不同程度的减轻。见图1。
2.4 EGB 761对小鼠T细胞亚群变化的影响 与正常组比较，模型组明显升高血中CD3+、CD4+含量，降低CD8+含量，差异均有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，EGB 761组明显降低血中CD3+、CD4+含量，升高CD8+含量，差异均有统计学意义(P<0.01)。见表4。
表3 3组结肠组织大体评分比较分)
*P<0.01与正常组比较 #P<0.01与模型组比较(SNK-q检验)
表4 3组T细胞亚群比较
*P<0.01 与正常组比较 #P<0.01与模型组比较(SNK-q检验)
2.5 3组免疫球蛋白水平比较 与正常组比较，模型组明显升高血中IgA、IgG、IgM含量，差异有统计学意义(P<0.01)；与模型组比较，EGB 761组明显降低血中IgA、IgG、IgM含量(P<0.01)，差异有统计学意义(P<0.01)。见表5。
表5 3组IgA、IgG、IgM比较
*P<0.01与正常组比较 #P<0.01与模型组比较(SNK-q检验)
2.6 EGB 761对小鼠结肠组织ICAM-1蛋白表达水平的影响 与正常组比较，模型组结肠组织ICAM-1阳性细胞染色面积明显增多；而EGB 761组ICAM-1阳性细胞蛋白染色面积较模型组明显减弱。见图2。
UC是一种高复发的慢性肠道炎症性疾病，是炎症性肠病的主要临床形式之一，但由于本病病程长、病变范围广被认为是结肠癌的癌前病变，目前公认本病是一种自身免疫性疾病。研究表明，体内免疫机制的异常诱导了UC的发生[4-5]；免疫反应的异常将进一步导致炎症细胞和炎症介质异常，T淋巴细胞(CD3+、CD4+、CD8+)是免疫反应中抗原递呈的核心环节，从而造成肠道黏膜组织的损伤。在正常情况下ICAM-1很少表达，当多种因素作用下使体内免疫系统被激活时，才会在各种炎症细胞上表达；肠道黏膜免疫反应的调节有赖于免疫细胞及免疫球蛋白(IgA、IgG、IgM)的参与[6-10]。因此，寻求更为有效的、且不良反应小的、不易复发的理想药物已成为研究的热点。
银杏是古老的树种，银杏叶的叶子、果实、种子均有较高的药用价值，它的药理作用不断被认识，临床应用范围逐步扩大。银杏叶中含有天然活性黄酮、苦内酯等对人体健康有益的多种成分，EGB 761广泛用于治疗呼吸系统、心脑血管系统等疾病，有调节循环系统、改善血液循环、保护黏膜组织等作用。研究表明，EGB 761可通过调节免疫机制，抑制炎性症状，对大鼠实验性结肠炎具有保护作用[11-14]。
免疫功能紊乱在UC发生发展中起重要作用，尤其是T淋巴细胞是免疫反应中抗原递呈的核心环节，T淋巴细胞亚群其中的一亚群功能增强，另一亚群功能减弱，引起亚群间比例紊乱[15]。本研究UC模型小鼠的T淋巴细胞亚群存在着紊乱，但经EGB 761干预后，EGB 761组T淋巴细胞亚群的紊乱得以调节，进一步抑制了炎症细胞和炎症介质异常，减少了肠黏膜组织损伤。表明EGB 761组中的结肠组织黏膜较模型组明显改善，充血及水肿明显减轻。IgG、IgA 参与UC的变态反应,并参与黏膜内局部免疫复合物的形成[16]。本研究结果显示EGB 761对异常增高的IgA、IgG有明显的抑制作用，说明该药治疗UC的机制与有效调节异常免疫反应有关。在正常肠黏膜中ICAM-1通常在毛细血管、微静脉和大血管内皮细胞低水平表达，而UC时ICAM-1在结肠组织中的分布和表达均明显增加，在机体免疫过程中起重要作用，使人们认识到直接针对ICAM-1的治疗可能成为一种新的手段。本研究结果显示，对UC模型组小鼠结肠组织行免疫组织化学染色可见ICAM-1阳性细胞染色明显增多，而经EGB 761干预后结肠组织中ICAM-1阳性细胞的染色明显减弱。表明EGB 761在急性期UC模型小鼠的机体免疫过程中起重要作用，这为临床治疗UC提供了理论依据。(本文图见封三)
[参考文献]
[1] Dupont A,Kaconis Y,Yang I,et al. Intestinal mucus affinity and biological activity of an orally administered antibacterial and anti-inflammatory peptide[J]. Gut，2015,64(2):222-232.
[2] Long TM,Nisa S,Donnenberg MS,et al. Enteropathogenic Escherichia coli inhibits type Ⅰ interferon-and RNase L-mediated host defense to disrupt intestinal epithelial cell barrier function[J]. Infect Immun,2014,82(7):2802-2814.
[3] Zhao H,Zhang H,Wu H,et al. Protective role of 1,25(OH)2 vitamin D3 in the mucosal injury and epithelial barrier disruption in DSS-induced acute colitis in mice[J]. BMC Gastroenterol,2012,12:57.
[4] Forte D,Ciciarello M,Valerii MC,et al. Human cord blood-derived platelet lysate enhances the therapeutic activity of adipose-derived mesenchymal stromal cells isolated from Crohn′s disease patients in a mouse model of colitis[J]. Stem Cell Res Ther,2015,6:170.
[5] Zhang H,Wu H,Liu L,et al. 1,25-dihydroxyvitamin D3 regulates the development of chronic colitis by modulating both T helper (Th)1 and Th17 activation[J]. APMIS,2015,123(6):490-501.
[6] Zeng JQ,Xu CD,Zhou T,et al. Enterocyte dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin expression in inflammatory bowel disease[J]. World J Gastroenterol,2015,21(1):187-195.
[7] Zhang YJ,Xu JJ,Wang P,et al. Multidrug resistance gene and its relationship to ulcerative colitis and immune status of ulcerative colitis[J]. Genet Mol Res,2014,13(4):10837-10851.
[8] Hartog A,Belle FN,Bastiaans J,et al. A potential role for regulatory T-cells in the amelioration of DSS induced colitis by dietary non-digestible polysaccharides[J]. J Nutr Biochem,2015,26(3):227-233.
[9] Schey R,Danzer C,Mattner J. Perturbations of mucosal homeostasis through interactions of intestinal microbes with myeloid cells[J]. Immunobiology,2015,220(2):227-235.
[10] Adachi T,Sakurai T,Kashida H,et al. Involvement of heat shock protein a4/apg-2 in refractory inflammatory bowel disease[J]. Inflamm Bowel Dis,2015,21(1):31-39.
[11] Wang L,Zhang T,Bai K. System evaluation on Ginkgo Biloba extract in the treatment of acute cerebral infarction[J]. Zhong Nan Da Xue Xue Bao： Yi Xue Ban，2015,40(10):1096-1102.
[12] Stark M,Behl C. The ginkgo biloba extract egb 761 modulates proteasome activity and polyglutamine protein aggregation[J]. Evid Based Complement Alternat Med,2014,2014:940186.
[13] Serrano-Garc
a N,Pedraza-Chaverri J,Mares-Sámano JJ,et al. Antiapoptotic Effects of EGb 761[J]. Evid Based Evid Based Complement Alternat Med，2013，2013:495703.
[14] 章静，吴香丽，刘丽霞，等.银杏叶提取物对大鼠视神经损伤后Bcl-2和Bax表达的影响[J].河北医科大学学报,2014,35(3):336-338.
[15] Ghaemi A,Sajadian A,Khodaie B,et al. Immunomodulatory Effect of Toll-Like Receptor-3 Ligand Poly I∶C on Cortical Spreading Depression[J]. Mol Neurobiol,2014,11(23):143-154.
[16] Stockinger S,Duerr CU,Fulde M,et al. TRIF signaling drives homeostatic intestinal epithelial antimicrobial peptide expression[J]. J Immunol,2014,193(8):4223-4234.
(本文编辑：许卓文)
[收稿日期]2016-06-17；
[修回日期]2016-07-19
[基金项目]河北省中医药管理局科研计划项目(2016180)
[作者简介]赵红伟(1979-)，女，河北玉田人，河北省人民医院主治医师，医学博士，从事消化科疾病诊治研究。
*通讯作者。E-mail:13603396653@163.com
[中图分类号]R574.62 [
文献标志码：] B [
文章编号：] 1007-3205(2017)09-1076-04
doi：10.3969/j.issn.1007-3205.2017.09.020