Table1ComparisonofthecontentsofMDAandSODinhippocampusofratsineachgroupp
·论著·
赵会颖1，杨永刚1，张建平1，李贵琴1，钱玉中2，李倩倩1
(1.河北省石家庄市第一医院老年病科，河北 石家庄 050011；2.河北省石家庄市第一医院中医科，河北 石家庄 050011)
[摘要]目的观察无创性肢体缺血预适应(noninvasive delayed limbischemic preconditioning，NDLIP)对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法将30只健康雄性SD大鼠随机分成假手术组、缺血再灌注组和NDLIP组各10只。NDLIP组大鼠给予左侧后肢缺血5 min、再灌注5 min，每天1次，连续操作3 d，然后再制作缺血模型；假手术组大鼠给予同样的麻醉和操作，但不进行颈总动脉的闭塞；假手术组和缺血再灌注组不进行NDLIP操作。检测各组大鼠海马超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量和Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达水平。结果缺血再灌注组和NDLIP组大鼠海马MDA含量明显高于假手术组，SOD含量明显低于假手术组，Bax、Caspase-3表达水平明显高于假手术组，Bcl-2表达水平明显低于假手术组；NDLIP组大鼠海马MDA含量明显低于缺血再灌注组，SOD含量明显高于缺血再灌注组，Bax、Caspase-3表达水平明显低于缺血再灌注组，Bcl-2 的表达水平明显高于缺血再灌注组。结论NDLIP能显著减少脑缺血再灌注损伤后凋亡的发生和氧化应激损伤，对脑缺血再灌注损伤具有保护作用。
[关键词]脑缺血；再灌注损伤；肢体远端缺血预适应；大鼠
doi：10.3969/j.issn.1007-3205.2017.11.002
脑缺血正逐渐成为世界范围内发病率和病死率的主要原因，主要病理生理表现是急性脑缺血-再灌注损伤[1]。许多关于中风的药理学神经保护策略的临床试验均令人失望，目前缺血性脑血管病的治疗方法是脑保护治疗和超早期静脉溶栓治疗[2]。肢体缺血预适应是指肢体短暂缺血后，肢体自身的肌肉或远隔部位的组织器官可以耐受较长时间的缺血损伤。由于肢体缺血预适应可通过对机体相对不太重要的器官进行预适应，从而达到保护机体重要器官的作用(如心脏、脑等)，因此其具备很好的临床应用价值，已经逐渐成为目前研究的热点。笔者采用无创性肢体缺血预适应(noninvasive delayed limbischemic preconditioning，NDLIP)的方法对大鼠缺血再灌注模型进行研究，旨在探讨其对大鼠脑再灌注损伤的保护作用及其相关机制。现报告如下。
1.1 实验动物及实验试剂 健康SPF级雄性SD大鼠30只，体质量240～280 g，由河北省实验动物中心提供。动物饲养室室温调节在22～25 ℃，给予动物12 h光照和12 h黑暗环境。主要试剂：超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)检测试剂盒(美国abcam公司)，β-actin抗体、Bax、Bcl-2及Caspase-3抗体(美国abcam公司)。大鼠分为假手术组、缺血再灌注组和NDLIP组各10只。
1.2 模型制作 NDLIP组大鼠麻醉后，以无创血压仪自制套管置于大鼠左后肢根部，加压，以脉搏消失、皮肤发绀、肢体远端皮温下降为缺血的依据；减压，以肢体远端皮温上升、脉搏出现、皮肤红润为再灌注的依据；给予左侧后肢缺血5 min、再灌注5 min，每天1次，连续操作3 d，然后再制作缺血模型。假手术组大鼠给予同样的麻醉和操作，但不进行颈总动脉的闭塞。假手术组和缺血再灌注组不进行NDLIP操作。
1.3 实验方法
1.3.1 试剂盒检测SOD和 MDA含量 各组取5只大鼠缺血再灌注24 h后断头取脑，分离大鼠海马组织，应用SOD和MDA试剂盒检测各组大鼠海马SOD和MDA的表达情况。
1.3.2 Western blot检测大鼠海马Bax、Bcl-2及 Caspase-3的表达 各组取5只大鼠麻醉后快速断头取脑，分离海马组织、提取蛋白。海马组织使用RIPA组织裂解液进行裂解(冰上30 min)，4 ℃条件下，应用离心机(16 000 r/min)将匀浆进行离心30 min，提取上清液，采用BCA法测定蛋白浓度。将样本加入每个泳道，应用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，室温下进行电泳(3 h)，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上(4 ℃、电压100 V)。放入5%脱脂牛奶的缓冲液中处理1 h。与下列抗体孵育(4 ℃ 过夜)：抗Bax抗体(1∶1 000)、抗Bcl-2抗体(1∶1 000)、抗Caspase-3抗体(1∶2 000)、β-actin抗体 (1∶2 000)。洗膜，室温暗室环境下与二抗孵育结合1 h。然后应用红外成像系统扫摸。每个目的蛋白的光密度值/β-actin 光密度值得出的比值为各目的蛋白相对表达量。
1.4 统计学方法 应用SPSS 18.0统计学软件分析数据，计量资料比较分别采用单因素方差分析和q检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 各组大鼠海马MDA和SOD含量比较 缺血再灌注组和NDLIP组大鼠海马MDA含量明显高于假手术组，SOD含量明显低于假手术组(P<0.05)；NDLIP组大鼠海马MDA 的含量明显低于缺血再灌注组，SOD含量明显高于缺血再灌注组(P<0.05)。见表1。
表1各组大鼠海马MDA和SOD含量比较
Table1ComparisonofthecontentsofMDAandSODinhippocampusofratsineachgroupp
*P<0.05与假手术组比较 #P<0.05 与缺血再灌注组比较(q检验)
2.2 各组大鼠海马Bax、Bcl-2及Caspase-3表达水平比较 缺血再灌注组和NDLIP组大鼠海马Bax、Caspase-3表达水平明显高于假手术组，Bcl-2表达水平明显低于假手术组(P<0.05)；NDLIP组大鼠海马Bax、Caspase-3表达水平明显低于缺血再灌注组，Bcl-2表达水平明显高于缺血再灌注组(P<0.05)。见表2，图1。
表2各组大鼠海马Bax、Bcl-2及Caspase-3蛋白表达水平比较
Table2ComparisonoftheexpressionlevelsofBax,Bcl-2andCaspase-3proteininhippocampusofratsineachgroup
*P<0.05与假手术组比较 #P<0.05与缺血再灌注组比较(q检验)
图1各组大鼠海马Bax、Bcl-2及Caspase-3蛋白表达
Figure1TheproteinexpressionofBax,Bcl-2andCaspase-3indifferentgroups
脑灌注全面或局灶性减少导致的脑缺血损伤是全世界范围内残疾和死亡发生的最常见和重要的原因。这些患者可能会遭受各种各样的难题，如运动障碍、感觉障碍、记忆障碍以及缺血性损伤导致的许多情绪和社会问题[3]。到目前为止，大多数症状并不能得到有效治疗。目前，急性缺血性脑损伤患者的神经保护或脑修复治疗并不能满足临床需求。药物治疗的效果也不尽如人意。因此，大脑保护机体自身免受有害刺激并从损伤中修复的内源性机制正在成为研究的热点。
缺血预适应为诱导内源性的神经保护作用提供了一种有效的方式。缺血预适应的概念最早是由Murry等[4]于1986年在缺血性心脏病模型中描述的。除了对心肌的保护作用，在肝脏、肾脏和大脑中，同样可以发现缺血预适应发挥对抗急性缺血再灌注损伤的现象[5-6]。通过动物实验发现反复的、短暂的、非致命性的缺血再灌注可使机体产生一系列内源性物质，可减小梗死面积，有效对抗持续致命性的脑缺血和再灌注损伤，被认为是一种强有力的内源性保护机制。但是，到目前为止，缺血预适应发挥神经保护的神经生物学机制仍然不是十分明确。
凋亡是一种程序化的死亡方式，以一系列明确的细胞形态和生物学改变为特征。大脑缺血后通过多种死亡信号通路激活凋亡的发生，尤其是Caspase的激活[7-8]。Caspases或半胱氨酸依赖性、天冬氨酸调控性蛋白酶，是一组在细胞凋亡中起重要作用的半胱氨酸蛋白酶[9]。研究者将Caspases定义为“刽子手”蛋白质，说明了其重要地位。有2种类型的凋亡相关Caspases酶：触发剂(顶端)Caspases和效应器(刽子手)Caspases酶。Caspase-9属于触发剂Caspases，而Caspase-3和Caspase-6属于效应器Caspases酶。Caspase-3可以促使DNA出现片段化，进而激活内切酶并分裂核DNA，最终引起细胞死亡，在线粒体调节的凋亡过程中起到了至关重要的作用。因此，Caspase-3促进凋亡发生[10]，通过对Caspase-3的抑制作用能有效抑制凋亡的进程。Bcl-2家族的蛋白质位于线粒体外膜，调控着下游Caspases的激活，故在线粒体调控的凋亡途径中扮演着关键的细胞内关卡作用[11-13]。Bcl-2家族主要包括Bcl-2和Bax，它们在功能上是截然相反的：Bcl-2是重要的凋亡抑制蛋白，Bax促进凋亡的发生[14-15]。本研究采用免疫印记方法检测Bax、Bcl-2及Caspase-3的表达，结果发现NDLIP下调海马Caspase-3和Bax的表达，但上调了海马Bcl-2的表达。表明NDLIP具有明显的抗凋亡特性。
MDA和SOD是与氧化应激密切相关的指标。MDA是氧化应激时脂质出现过氧化反应的产物，MDA与氧化应激的程度呈正相关[16]，可视为与氧化应激损伤密切相关的代表性标志物。氧化应激损伤会损害抗氧化防御系统，影响抗氧化物酶的表达[17]。大脑缺血再灌注损伤与氧化应激损伤密切相关[18-20]。缺血再灌注后脑组织产生大量的氧自由基，影响细胞膜中磷脂的多聚不饱和脂肪酸，引起脂质过氧化反应，产生大量的脂质过氧化物和自由基，导致脑组织细胞功能和(或)结构的变化。本研究结果显示，缺血再灌注组大鼠海马MDA含量明显高于假手术组，SOD的活性明显降低于假手术组，NDLIP组大鼠海马MDA的含量明显低于缺血再灌注组，SOD含量明显高于缺血再灌注组。表明NDLIP能够有效地减少缺血再灌注后大鼠脑中氧自由基的损伤，增强大脑的抗氧化应激能力，这可能是NDLIP对大脑产生保护作用的生物学机制之一。
总之，缺血或缺氧预适应的调节机制是一个复杂的细胞调控过程，包括多重细胞信号通路，从而增强机体对缺血、缺氧的耐受性。到目前为止，有许多机制可能与缺血损伤的调节作用有关，尤其是在冠心病方面。已经发现多种关键分子和信号传导途径，包括GABA受体、诱导型一氧化氮合成酶、腺苷、热休克蛋白等。可以肯定的是，脑缺血耐受可以保护神经元，还能有效维持大脑功能。但是，关于这种类型的调节或交叉耐受性之间的关系，所涉及的研究很少。今后将进一步研究各种调节方法的共同机制，从而能够从药理学上开发其保护作用。
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ZHAO Hui-ying1, YANG Yong-gang1, ZHANG Jian-ping1, LI Gui-qin1, QIAN Yu-zhong2, LI Qian-qian1
(1.DepartmentofGeriatricsandGerontology,theFirstHospitalofShijiazhuangCity,HebeiProvince，Shijiazhuang050011,China; 2.DepartmentofTraditionalChineseMedicine,theFirstHospitalofShijiazhuangCity,HebeiProvince，Shijiazhuang050011,China)
[Abstract]]ObjectiveTo study the protective effect of noninvasive delayed limb ischemia preconditioning(NDLIP) on cerebral ischemia reperfusion injury in rats.MethodsThirty healthy male SD rats randomly divided into 3 groups, Sham-operated group, ischemic-reperfusion group and NDLIP group(n=10/group). Rats in NDLIP group were subjected to 5 minutes ischemia/5 minutes reperfusion on the left hind limb once a day for 3 consecutive days, then all rats were subjected to cerebral ischemia reperfusion injury. The Sham-operated group gave the same anesthesia and operation, but did not carry out the occlusion of the common carotid artery. The sham-operated group and ischemic-reperfusion group were not performed NDLIP operation. The expression of superoxide dismutase(SOD) and malondialdehyde(MDA) was detected by the kit. The protein expression of Bax, Bcl-2 and Caspase-3 were detected by Western blotting.ResultsCompared with the rats in the Sham-operation group, the contents of the hippocampal MDA, Bax and Casaspe-3 were significantly higher in the ischemic-reperfusion group. Compared with the rats in the ischemic-reperfusion group, the contents of the hippocampal MDA, Bax and Casaspe-3 were significantly decreased in the NDLIP group. Compared with the rats in the Sham-operation group, the contents of the hippocampal SOD and Bcl-2 were significantly decreased in the ischemic-reperfusion group. Compared with the rats in the ischemic-reperfusion group, the contents of the hippocampal SOD and Bcl-2 were significantly increased in the NDLIP group.ConclusionNDLIP could significantly reduce the occurrence of apoptosis and oxidative stress damage after cerebral ischemia reperfusion injury, it has protective effect on cerebral ischemia reperfusion injury.
[Key words]brain ischemia; reperfusion injury； limb ischemia preconditioning; rats
[收稿日期]2017-09-19；
[修回日期]2017-09-30
[基金项目]河北省科技计划项目(15277785D)
[作者简介]赵会颖(1964-)，女，天津人，河北省石家庄市第一医院主任医师，医学硕士，从事老年病诊治研究。
[中图分类号]R743.31
[文献标志码]A
[文章编号]1007-3205(2017)11-1244-04
(本文编辑：赵丽洁)