表1Hardy-Weinberg遗传平衡测试
Table1Hardy-Weinberggeneticequilibriumtest(例数)
·论著·
孙红梅，冯建纯，李 刚，孔祥龙，刘 相，邸红芹*
(河北省胸科医院检验科，河北 石家庄 050041)
[摘要]目的探讨Toll样受体2(Toll-like receptor 2，TLR2)基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)与结核病遗传易感性之间的关系。方法采用结核病例和正常对照研究方法进行实验设计，采用SNaPshot技术分析法检测河北地区205例正常人和214例肺结核患者(均为汉族人)TLR2基因的rs5743708与rs3804099位点的多态性，并进行基因型频率和等位基因频率的比较，通过Logistic分析这些基因的多态性与结核病的易感性之间的关系。结果选取的214例结核患者与205例正常人的年龄和性别差异无统计学意义，且年龄和性别因素对研究结果的影响差异无统计学意义(P>0.05)。经χ2检验rs5743708和rs3804099位点的基因频率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。与对照组相比，结核组的rs5743708位点基因型(χ2=0.925，P=0.336)及等位基因(χ2=0.921，P=0.337)、rs3804099位点的基因型(χ2=3.388，P=0.184)及等位基因(χ2=2.843，P=0.092)差异均无统计学意义(P>0.05)，其中rs5743708位点的CT基因型相对于CC基因型患结核的风险有所增加，但差异无统计学意义(P>0.05)。结论TLR2的 rs5743708和rs3804099位点多态性与河北地区汉族人的结核易感性没有显著的相关性。
[关键词]结核；多态性，单核苷酸；Toll样受体2
doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2017.12.020
结核病是由结核分枝杆菌感染引起的严重影响公共卫生的疾病[1-2]。大多数感染结核菌者可被自身免疫系统清除而自愈，表明宿主遗传因素的变化对结核易感性具有重要影响[3-4]。Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)位于单核/巨噬细胞表面，能够特异性识别病原体相关分子模式，并且启动信号转导途径，从而激活先天性免疫应答反应、细胞因子和适应性免疫应答反应等[5-8]。TLR2基因位于4号染色体(4q32)上，其在抗结核免疫中起到关键性作用[9-12]。本研究对河北地区汉族人群肺结核患者的TLR2基因进行分型，旨在分析TLR2基因多态性与肺结核易感性的相关性。
1.1一般资料 选取2014年4月—2015年12月在河北省胸科医院住院治疗的结核患者，均为河北籍汉族人，经胸片和临床诊断证实为结核患者共214例，男性108例，女性106例，年龄 14～87岁，平均(40.89±18.42)岁。同时选取在河北省胸科医院常规体检的志愿者205例，均为河北籍汉族人，且与上述结核患者无血缘关系，男性102例，女性103例，年龄15～85 岁，平均(40.92±17.51)岁。2组年龄和性别差异均无统计学意义，具有可比性。
本研究均告知并征得患者本人同意，研究方案经医院伦理委员会批准。
1.2DNA提取 应用乙二胺四乙酸二钾( Edathamil,EDTA-K2)抗凝管在无菌条件下，采集所有研究对象清晨空腹静脉血2 mL，-70℃冰箱保存。按照全血样树脂型TM基因组DNA抽提试剂盒(北京赛百盛基因技术有限公司)的操作说明提取DNA。取2 μL DNA模板进行1%琼脂糖凝胶电泳(120V，20 min)检测DNA的完整性。另取2 μL DNA经Nanodrop核酸分析仪测定DNA浓度及OD260/OD280(要求所有样品浓度均为40 μg/μL以上；OD260/OD280在1.75以上)。-20 ℃保存DNA备用。
1.3引物设计及合成 根据GenBank所提供的基因序列和相关文献报道，应用Primer Premier 5软件设计所需的PCR引物。引物合成、PCR体系优化和PCR扩增及测序的工作均委托英潍捷基(上海)贸易有限公司完成。为了保证该实验方法的真实、可靠性，本研究选择在给公司送检样本时，从2组研究对象的样本中，随机抽取5%的样本对研究位点进行复检，结果符合率为100%，说明实验室控制结果符合预期。
2个位点的扩增引物设计：rs5743708位点的上游引物的序列为5′-CCTGGCAAGTGGATCATT-GAC-3′，下游引物序列为5′-CCTAGGACTTTAT-CGCAGCTCTC-3′；rs3804099位点的上游引物的序列为5′-TGCTGGACTTACCTTCCTTGAG-3′，下游引物序列为5′-AGCCTCCGGATTGTT-AACG-3′。PCR反应体系(20 μL)为：10×PCR Buffer(Mg2+free)2 μL，MgCl2(50 mmol/L)0.8 μL，dNTP(10 mmol/L)0.5 μL，Primer Mix 0.5 μL，DNA模板1 μL，Platinum Taq(5U)0.5 μL，ddH2O 14.2 μL。PCR扩增程序：95℃ 2 min；95 ℃ 20 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共33个循环；72 ℃ 5 min。
1.4PCR产物纯化 PCR产物的纯化(10 μL)体系：SAP(1 U/μL) 0.3 μL，ExoI(20 U/μL) 0.2 μL，ddH2O 7.5 μL，PCR产物 2 μL。振荡混匀，37 ℃保温100 min，75 ℃保温15 min灭活SAP和ExoI酶，4 ℃保存24 h。
1.5SNaPshot 延伸反应 SNaPshot 延伸反应所需要的引物(Yrs5743708)序列为5′-TTTTTTTT-TTTTTTTTTTGGTCTTGGTGTTCATTATCT-TC-3′，(Yrs3804099)序列为5′-TTTTTTTTTTT-TTTTTTTAAAGTTTGAAGTCAATTCAGAA-3′。延伸反应体系(5 μL)：Reaction mix 2.5 μL，PCR 产物1.5 μL，Probe Mix 0.7 μL，GC buffer 0.3 μL。延伸反应程序：96 ℃ 10 s；51 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共25个循环；4 ℃放置。
1.63730扫板分析 在96孔板的每个孔中分别加入1 μL上述纯化延伸产物，与0.5 μLGenescanTM-120 LIZ Size Standard和8.5 μL去离子甲酰胺混合均匀后，经95℃变性5 min，直接进行3730扫板，分析位点峰值与位置的情况。
1.7统计学方法 应用SPSS 16.0 统计软件分析数据。计量资料比较采用独立样本的t检验；计数资料比较采用χ2检验；危险因素确定采用Logistic回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1研究对象基因型的遗传平衡分析 本研究采用多重SNaPshot分析法进行基因型的分析，结果显示位点rs5743708有2个基因型CC和CT，rs3804099有3个基因型TT、TC和CC。该结果与理论结果(Genebank给出的序列)一致，与前期的研究结果相符，说明本研究结果真实可信。根据2组研究对象的基因型分析结果，分别计算各组不同基因位点的基因型，根据Hardy-Weinberg平衡定律计算不同基因型位点的观察值与预期值。经χ2检验后发现，结核组和对照组的rs5743708位点和rs3804099位点中不同基因型频率的预期值与观察值均差异无统计学意义(P>0.05)。说明研究对象的基因频率分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。见表1。
表1Hardy-Weinberg遗传平衡测试
Table1Hardy-Weinberggeneticequilibriumtest(例数)
2.2单个SNP位点与结核易感性分析 结核组和对照组在rs5743708位点的CC、CT、TT基因频率和等位基因以及在rs3804099位点的TT、TC、CC基因型频率和等位基因频率差异均无统计学意义(P>0.05)。对2个位点的等位基因和基因型的频率分布进行统计分析发现，rs5743708位点等位基因T相对于等位基因C患结核的风险增加了188.7%。见表2。
表2各位点基因型和等位基因在结核组与
对照组中的分布情况
Table2DistributionofgenotypeandalleleinTBandcontrolgroup(例数，%)
进一步分析发现，rs5743708位点的CT基因型相对于CC基因型患结核的风险增加了190%(OR=2.900，95%CI=0.299～28.112)。说明杂合基因型患结核的风险更高。见表3。
但因为带有CT基因型的人数较少，需要进一步加大样本量验证。
表3各SNP位点基因型与结核易感性的关联
Table3AssociationofSNPlocigenotypeswithsusceptibilitytotuberculosis
本研究所有研究对象均为随机选取，为去除年龄、性别对TLR2的2个位点基因型和结核发病易感性的影响，应用多因素Logistic统计方法[以诊断为结核为因变量(否=0，是=1)，以性别(女性=0，男性=1)、年龄(<40=0，≥40=1)为自变量]进行分析，结果显示所有研究对象的年龄和性别对于研究结果影响差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。
表4年龄和性别因素对结核影响的Logistic回归分析
Table4Logisticregressionanalysisoftheinfluenceofageandsexontuberculosis
根据世界卫生组织的报道，2015年全球有1 040万人患结核病，180万人因结核病死亡，6个国家占到结核病新发病例的60%，印度在数量上居首，随后是印度尼西亚、中国、尼日利亚、巴基斯坦和南非。近年来，随着各个国家和地区对于结核病的重视程度的提高，人们对于结核病的发病、结核相关易感基因和耐药基因的研究也越来越多[13-14]。很多前期研究已经证明结核病是受多种遗传因素和环境因素共同作用影响的，已证实的相关易感性基因包括人类自然抵抗相关蛋白1、Toll样受体家族、NOD样受体、C型凝集素受体等[15-18]。但到目前为止，还未找到在所有人群中均普遍存在的、与结核分枝杆菌密切相关的易感基因。在这样的前提下，将研究的目光主要集中到TLR2及其调控的信号通路中，通过比较结核患者与正常人的TLR2基因的差异性探讨其与结核易感性的相关性。
大量研究证实TLR2及其信号通路在抗结核免疫中起关键作用[19-21]，不仅TLR2介导的信号转导途径可以产生许多细胞因子，能够促进后续的适应性免疫应答反应，而且由TLR2介导的许多重要刺激途径也能够影响宿主对抗原的适应性免疫应答反应能力。研究发现敲除或者抑制TLR2基因以后，可以影响机体内参与机体免疫反应的多条信号通路[22-23]。提示TLR2的基因缺陷可能增加机体对结核杆菌的易感性。
随着对基因多态性了解的深入，基因多态性与疾病易感性的研究也不断取得突破。TLR2的rs5743708即Arg753Gln位点的等位基因多态性十分少见，杂合子出现频率非常低，并且没有纯合子出现。本研究结果这证实了这一点，这与关于韩国人中的Arg753Gln位点的等位基因多态性研究结果一致，但与欧洲人的有关报道大不相同[24]，这也说明欧洲人的Arg753Gln位点的突变率远高于亚洲人。同时进一步研究发现，该位点的基因型与等位基因在结核组和对照组之间差异无统计学意义。TLR2的rs3804099即Asn199Asn位点也是多态性位点，笔者前期研究显示TLR2 rs3804099 的CC基因型与结核易感性相关[25]，但本研究结果所得到的TLR2基因多态性对结核易感性的影响差异无统计学意义。不容忽视的是rs5743708位点等位基因T相对于等位基因C患结核的风险性增加，且CT基因型相对于CC基因型患结核的风险有所增加。
综合考虑到不同种族或不同地区之间人类基因的细微差异、样本选择差异、鉴定基因型方法差异等均可能造成研究结果的不同。为了进一步了解TLR2基因及其信号通路是如何影响结核病易感性的，尚需要进行更加深入、系统、大样本量的研究，以期尽快找到与结核易感性密切相关的基因位点，以便进行更为精准的诊疗，降低结核的病死率，从而在根本上减轻患者的痛苦和经济负担。
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SUN Hong-mei, FENG Jian-chun, LI Gang, KONG Xiang-long, LIU Xiang, DI Hong-qin*
(DepartmentofLaboratoryMedicine,HebeiChestHospital,Shijiazhuang050041,China)
[Abstract]ObjectiveTo explore the association of single nucleotide polymorphisms(SNP) in Toll-like receptor 2(TLR2) gene with the susceptibility to tuberculosis(TB).MethodsTwo hundred and five cases of normal people and two hundred and fourteen cases of tuberculosis patients were analyzed by the method of micro-sequencing technology(SNaPshot) in Hebei area via the genotypic and allelic frequencies of TLR2(rs5743708 and rs3804099). The relationship between TLR genotypes and the susceptibility to tuberculosis was analyzed by logistic regression models.ResultsThere was no significant difference between the age and gender of 214 patients with tuberculosis and 205 cases of normal people(P>0.05), and the effects of age and gender factor on the results of the study were not statistically significant(P>0.05). The distribution of gene frequency in rs5743708 and rs3804099 conformed to the Hardy-Weinberg equilibrium law by χ2test. Compared with control group, there were not significant difference on the rs5743708 genotype(χ2=0.925,P=0.925) and allelic frequencies(χ2=0.921,P=0.921), the genotype of rs3804099 loci(χ2=3.388,P=3.388) and allele(χ2=2.843,P=2.843) of TB group(P>0.05). The risk of CT genotype at the rs5743708 site was increased compared with the CC genotype, but there was no statistical significance(P>0.05).ConclusionThe polymorphism of TLR2(rs5743708 and rs3804099) has no significant correlation with the incidence of tuberculosis in the han nationality of hebei province.
[Key words]tuberculosis; polymorphism, single nucleotide; Toll-like receptor 2
[收稿日期]2017-09-12；
[修回日期]2017-10-20
[基金项目]河北省医学科学研究重点课题(1020140085)
[作者简介]孙红梅(1982-)，女，河北邢台人，河北省胸科医院主管技师，医学硕士，从事临床检验学研究。
*通讯作者。E-mail:15633037120@163.com
[中图分类号]R521
[文献标志码]A
[文章编号]1007-3205(2017)12-1443-05
(本文编辑：许卓文)