Table1Theeffectsofm-NisonthemPAPandtheRVSPinhypoxicpulmonaryhypertensionrats
杜梅素,李朝鹏 ,王亮亮，李 娜，杜景霞
(邢台医学高等专科学校基础医学部，河北 邢台 054000)
[摘要]目的探讨间尼索地平(m-nisoldipine，M-NIS)对低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)大鼠肺动脉压和肺动脉重构的作用。方法①将50只Wistar 大鼠随机分为正常对照组、模型组、M-NIS组，硝苯地平(nifedipine ，NIF)组,模型组20只，其他组各10只。正常对照组在自然环境下饲养4周。剩余3组均置于低压低氧舱中饲养4周，8 h/d。自第2周起，各组每天进舱前给药1次，连续给药 3周。4周后，比较各组大鼠的平均肺动脉压(mean pulmonary arterial pressure，mPAP)、右心室收缩压(right ventricular systolic pressure，RVSP)、右心室肥厚指数(right ventricular hypertrophy index，RVHI)，计算出管壁厚度占外径的百分比( WT%)和管壁面积占血管总面积的百分比(WA%)。②取模型组大鼠的肺动脉干制备血管环，用离体血管实验法，以KCl、去氧肾上腺素(phenylephrine，PHE)在含钙离子和不含钙离子的K-H液中预收缩离体大鼠肺动脉环，观察M-NIS对血管收缩的影响。结果①M-NIS和NIF组大鼠的mPAP、RVSP、RVHI、WT%、WA%显著低于模型组(P<0.05)，模型组大鼠的上述指标显著高于正常对照组(P<0.05)。②在含钙离子的K-H液中，M-NIS抑制KCl(30 mmol/L、50 mmol/L)和PHE(5×10-8mol/L、5×10-7mol/L)所致血管收缩的IC50分别为8.52×10-9mol/L、1.29×10-7mol/L和2.81×10-8mol/L、5.23×10-7mol/L。在无钙离子K-H液中，间尼索地平无抑制离体血管收缩的作用。结论间尼索地平对大鼠的HPH有治疗作用。
[关键词]高血压，肺性；间尼索地平；大鼠
doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2018.01.003
低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension，HPH)是由慢性低氧导致的，是慢性肺源性心脏病和各型高原病发生发展中重要病理变化之一，其特征性病理生理表现是肺血管收缩和肺循环高压,病变进行性发展可发生右心衰竭而死亡。HPH发生发展的2个重要环节包括低氧性肺血管收缩和肺血管重构[1-3]。间尼索地平(m-nisold ipine，M-NIS)属于二氢吡啶类钙拮抗剂，其主要药理作用是选择性扩张外周血管和冠状动脉血管，其毒性很小，光稳定性强，有望成为治疗心血管疾病的理想药物[4]。本研究旨在探讨间尼索地平对大鼠HPH的影响。
1.1仪器和试剂 多道生理信号采集处理系统(RM-6240，成都仪器厂)，DHY-3000型低压氧舱(贵州风雷军械机械有限公司)。间尼索地平购自河北医科大学；硝苯地平购自石家庄新华制药厂；KCl(天津市标准科技有限公司)；去氧肾上腺素(phenylephrine，PHE，上海禾丰制药有限公司)。K-H液(浓度 mmol/L)：NaCl 117.9，KCl 4.7，KH2PO41.2， MgSO4·7H2O 1.6， CaCl22.5， NaHCO323.8，Glu·H2O 11.0。无钙的K-H液，以EGTA50 μmol/L取代CaCl2。
1.2动物 Wistar大鼠,体质量(200±20) g，雌雄各半，购自河北省实验动物中心。
1.3方法
1.3.1受试药母液的制备 用二甲基亚砜作为溶剂，将M-NIS配制为(1×10-9～ 3×10-2) mol/L的溶液，离体血管实验时，按需取相应母液20 μL至20 mL K-H液的恒温浴管中，计算结果以药物的终浓度表示。
1.3.2动物分组及给药 取50只健康的Wistar大鼠，随机分成正常组、模型组、M-NIS组，NIF组,模型组 20 只，其他组各10只。正常组在自然环境下饲养4周。剩余3组均置于模拟海拔5 000～5 500 m高度的高原环境的低压低氧舱中饲养4周，8 h/d。自第2周起，各组每天进舱前给药1次，连续给药 3周。正常组、模型组每次0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)灌胃5 mL/kg，M-NIS组每次灌胃给药为M-NIS 2.0 mg/kg(与0.5%CMC-Na制成混悬液)，NIF组每次灌胃给药为NIF 2.0 mg/kg(与0.5%CMC-Na制成混悬液)。对大鼠进行处理4周后，进行各项实验指标测定。
1.3.3血流动力学、右心肥厚指数、WT%、WA%的测定[5-8]动物饲养到规定时间，用戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉后，仰卧固定于手术台上,采用右心导管法(是评价右心功能和测量肺动脉压的金标准[9-10])，分离右侧颈外静脉，将导管插入肺动脉,将导管另一端接压力传感器,用RM-6240多道生理信号采集处理系统测定平均肺动脉压(mean pulmonary arterial pressure，mPAP)及右心室收缩压(right ventricular systolic pressure，RVSP)。
测定完血流动力学后，将心脏及肺脏从胸腔整体取出，用K-H清洗分离出心脏和肺脏。
分离出心脏后，沿房室沟剪去心房组织和大血管根部，并沿室间隔边缘剪下右心室游离壁(right ventricu tar free wall mass，RV)及左心室加室间隔(left ventricular plus septal，LV+S)。滤纸吸干余血后，用电子天平称量RV和LV+S，然后计算右心室肥厚指数(right ventricular hypertrophy index，RVHI)。RVHI=[RV/(LV+S)]×100%。
将分离出的肺脏，用10%甲醛固定，用石蜡包埋切片，HE 染色，观察肺小动脉的形态学变化。通过采集及分析图像软件(SPOT COOL CCD软件及MAGEPRO Plus 4.1软件)，测量出管壁厚度、肺小动脉外径、管壁面积及血管总面积，并计算出管壁厚度占外径的百分比( WT%)和管壁面积占血管总面积的百分比(WA%)。WT%和WA%可反映肺小动脉管壁增厚重建的情况。
1.3.4离体肺动脉环实验方法 将分离出的模型组的肺脏，浸泡于盛有4 ℃预冷、预氧饱和的K-H液培养皿中，迅速分离出肺动脉干，剪成3～4 mm长的动脉环，将其置于含20 mL K-H液的恒温浴管中，持续通入混合气(95% O2+5% CO2)，连接张力传感器，记录血管环张力的变化，前负荷1 g，稳定1 h后开始试验，稳定过程中每15 min换1次新鲜K-H液[11-14]。
用KCl(30 mmol/L和50 mmol/L)或PHE(5×10-8mol/L和5×10-7mol/L)作为刺激液。用刺激液刺激血管环收缩，达最大幅度后灌洗3次，使血管环逐渐恢复至刺激前的状态，平衡15 min，再次给予刺激液刺激血管收缩，2次收缩幅度相差小于8%(说明血管收缩具有可重复性)，进行后续实验，反之弃之。分别给予不同浓度的M-NIS溶液，孵育血管环15 min，再加入刺激液，计算出给药后收缩反应的抑制率。溶剂和NIF组方法同上。
1.4统计学方法 应用SPSS 16.0统计软件分析数据，计量资料比较分别采用F检验、SNK-q检验和配对t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1M-NIS对HPH大鼠的影响 M-NIS组及NIF组大鼠mPAP、RVSP、RVHI、WT%、WA%显著低于模型组(P<0.05)；模型组大鼠上述指标显著高于正常对照组(P<0.05)。见表1，2。
表1M-NIS对HPH大鼠mPAP和RVSP的影响
Table1Theeffectsofm-NisonthemPAPandtheRVSPinhypoxicpulmonaryhypertensionrats
*P<0.05与正常对照组比较 #P<0.05与模型组比较 △P<0.05与M-NIS组(SNK-q检验)
表2M-NIS对HPH大鼠RVHI、WT%、WA%的影响
Table2Theeffectsofm-NisontheRVHI,WT%andWA%inhypoxicpulmonaryhypertensionrats
*P<0.05与正常对照组比较 #P<0.05与模型组比较 △P<0.05与M-NIS组(SNK-q检验)
2.2M-NIS对HPH大鼠离体肺动脉收缩的影响
2.2.1KCl、PHE收缩离体大鼠肺动脉的作用 KCl(10、20、30、50、70、90、100 mmol/L)引起离体大鼠肺动脉收缩的效能(%)分别为2.9±1.1、11.7±2.4、28.5±2.7、62.9±3.3、86.8±3.5、97.6±3.1、100.0±0.0。PHE(1×10-8、5×10-8、1×10-7、5×10-7、1×10-6、3×10-6、5×10-6mol/L )引起离体大鼠肺动脉收缩的效能(%)分别为3.2±1.1、18.2±2.5、29.5±3.4、68.4±2.8、83.2±2.5、95.2±2.3、100.0±1.0。两者均可浓度依赖性地引起离体大鼠肺动脉收缩。见图1，2。
图1KCl收缩离体大鼠肺动脉的作用
Figure1ThecontractioninducedbyKClinisolatedratpulmonaryarterialrings
图2PHE收缩离体大鼠肺动脉的作用
Figure2ThecontractioninducedbyPHEinisolatedratpulmonaryarterialrings
选用引起血管环明显收缩效能的KCl浓度(30、50 mmol/L)及PHE浓度(5×10-8、5×10-7mol/L)作为实验中各刺激液的浓度。
2.2.2M-NIS对KCl导致离体大鼠肺动脉收缩的作用 M-NIS抑制KCl(30、50 mmol/L)导致血管收缩的IC50分别为8.52×10-9mmol/L、1.29×10-7mmol/L。NIF抑制KCl(30、50 mmol/L)所致血管收缩的IC50分别为4.59×10-8mol/L、7.95×10-7mol/L。在无钙K-H液中，KCl无诱导肺动脉收缩的作用，再用M-NIS或NIF孵化血管，血管环也无反应。见图3，4。
2.2.3M-NIS对PHE导致离体大鼠肺动脉收缩的作用 M-NIS抑制PHE(5×10-8、5×10-7mol/L)导致血管收缩的IC50分别为2.81×10-8mol/L、5.23×10-7mol/L。NIF抑制PHE(5×10-8、5×10-7mol/L)所致血管收缩的IC50分别为(4.34×10-7、9.97×10-6mol/L)。见图5，6。在无钙K-H液中，PHE可诱导肺动脉收缩，用M-NIS及NIF孵化血管，治疗前与治疗后差异均无统计学意义(P>0.05),即均不能抑制血管收缩。见表3。
表3M-NIS对PHE所致离体大鼠肺动脉收缩的影响
Table3Theeffectsofm-NisonthecontractioninducedbyPHE5×10-8mol/Land5×10-7mol/Linisolatedratpulmonaryarterialrings
图3M-NIS对KCl导致离体大鼠肺动脉收缩的作用
Figure3Theantagonisticeffectsofm-NisonthecontractioninducedbyKClinisolatedratpulmonaryarterialrings
图4NIF对KCl导致离体大鼠肺动脉收缩的作用
Figure4TheantagonisticeffectsofNifonthecontractioninducedbyKClinisolatedratpulmonaryarterialrings
图5M-NIS对PHE导致离体大鼠肺动脉收缩的作用
Figure5Theantagonisticeffectsofm-NisonthecontractioninducedbyPHEinisolatedratpulmonaryarterialrings
图6NIF对PHE导致离体大鼠肺动脉收缩的作用
Figure6TheantagonisticeffectsofNifonthecontractioninducedbyPHEinisolatedratpulmonaryarterialrings
高原生活、肺心病、慢性阻塞性肺病等均可导致低氧性肺动脉高压，低氧性肺动脉高压控制不佳可继续发展为高原性肺水肿、高原性心脏病、心力衰竭甚至死亡。可见，要控制高原心脏病的发生发展必须降低肺动脉高压，故寻找有效的抗肺动脉高压药物迫在眉睫[6，15]。
常见的肺动脉高压模型包括低压低氧模型、体-肺循环的分流模型、野百合碱模型。研究高原性心脏病，适宜选用低压低氧模型[16]。本研究建立低氧性肺动脉高压动物模型的方法是：将大鼠置于低压氧舱内，模拟海拔5 000 m高原的连续缺氧条件。初始，低氧导致肺小动脉收缩及肺动脉压暂时性升高，随着低氧时间延长，肺动脉发生管壁变厚、管腔缩小、顺应性下降等重构，肺血管阻力和肺动脉压持续升高。可见，肺动脉高压发生发展的关键是：低氧性肺小动脉收缩及在此基础上的肺血管重构[17]。
本研究离体血管实验部分，用KCl和PHE刺激肺动脉收缩，观察到M-NIS有舒张肺动脉的作用，可缓解肺小动脉收缩。
高钾溶液使细胞膜电位除极化，从而激活细胞膜上的电压依赖性钙通道，钙离子内流导致血管收缩[18]。在不含钙K-H液中，KCl不能诱导血管收缩。M-NIS和NIF均明显拮抗KCl缩血管作用，是电压依赖性钙拮抗剂。
PHE 通过诱导细胞外钙内流和促进细胞内钙释放而收缩血管[18]，故在无钙K-H液中，PHE 的缩血管作用较低。可能由于M-NIS和NIF无促进细胞内钙释放的作用，故在含钙的K-H液中，两药有抗PHE缩血管作用，而在无钙K-H液中， 两药无抗PHE缩血管作用。
本研究结果显示，M-NIS组大鼠 mPAP、RVSP、RVHI、WT%和WA%均显著低于模型组(P<0.05)，说明M-NIS可降低肺动脉压和逆转血管重构，可为治疗肺动脉高压提供参考。
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DU Mei-su, LI Chao-peng, WANG Liang-liang, LI Na, DU Jing-xia
(DeparementofBasicMedicine,XingtaiMedicalCollege,HebeiProvince,Xingtai054000,China)
[Abstract]ObjectiveTo discover the effects of m-nisoldipine(M-NIS) on pulmonary arterial pressure and pulmonary vascular remodeling in hypoxic pulmonary hypertension(HPH) rats.Methods①Fifty wistar rats were randomly divided into four groups: normal group, model group, M-NIS group and nifedipine(NIF) group. There were twenty rats in the model group and ten rats in other groups respectively. Rats in the normal group were kept in a normal environment for four weeks. Rats in other groups were kept in a hypobaric oxygen chamber for eight hours each day for four weeks. Rats in each group were administrated with corresponding drugs from the second week for three weeks. At the end of the fourth weeks, the mPAP, RVSP, RVHI, WT% and WA% in each group were measured or calculated. ②The isolated rat pulmonary arterial rings were selected from the model group. We used isolated artery experiment to observe the antagonistic effects of M-NIS on the contraction induced by KCl and PHE in isolated rat pulmonary arterial rings in the calciferous and calcium-free K-H solution.Results①The mPAP, RVSP, RVHI, WT%, WA% in M-NIS and NIF groups were lower than those of the model group(P<0.05), and the above indexes in model group were higher than those of the normal group(P<0.05) . ②In the calciferous K-H solution，M-NIS has antagonistic effect on the contraction induced by KCl(30 mmol/L, 50 mmol/L) and PHE(5×10-8mol/L, 5×10-7mol/L)in isolated rat pulmonary arterial rings. The IC50was 8.52×10-9mol/L, 1.29×10-7mol/L and 2.81×10-8mol/L, 5.23×10-7mol/L, respectively. In the calcium-free K-H solution，M-NIS had no effect.ConclusionM-NIS has therapeutical effect in hypoxic pulmonary hypertension rats.
[Key words]hypertension, pulmonary； m-nisoldipine； rats
[收稿日期]2017-07-25；
[修回日期]2017-09-05
[基金项目]邢台市市级科技计划细化项目(2015ZZ027-4)
[作者简介]杜梅素(1980-)，女，河北邢台人，邢台医学高等专科学校讲师，医学硕士，从事心血管药理学研究。
[中图分类号]R544
[文献标志码]A
[文章编号]1007-3205(2018)01-0011-05
(本文编辑：刘斯静)