Table1Comparisonofmaximumtensilefracturestrengthof2groupsoftendonsatdifferenttimepoints
白江博，赵红芳，张 冰，于昆仑，马 韬，田德虎*
(河北医科大学第三医院手外科，河北省骨科生物力学重点实验室，河北 石家庄 050051)
[摘要]目的采用冻干羊膜重建腱鞘缺损，探讨其对肌腱愈合及肌腱粘连的早期生物力学的影响。方法选取来亨鸡40只，随机分为实验组及对照组，每组20只。选用来亨鸡双足第Ⅲ足趾肌腱及腱鞘损伤模型：实验组缝合趾屈深肌腱断端后用两层冻干羊膜重建缺损的腱鞘；对照组直接缝合趾屈深肌腱断端，不进行腱鞘的修复。术后1、2、3、4周取材行生物力学检测，观察2组肌腱最大拉伸断裂强度及拉断肌腱粘连带功耗。结果实验动物均存活至实验完成，切口愈合好。2组均在2周时最大拉伸断裂强度下降，3周和4周时逐渐升高，术后1、2、3、4周各个时点实验组肌腱最大拉伸断裂强度均大于对照组，差异有统计学意义(P<0.05);2组拉断肌腱粘连带功耗在1、2、3、4周均呈逐渐升高趋势，实验组在1、2、3、4周每个时点拉断肌腱粘连带功耗均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论冻干羊膜重建腱鞘缺损能阻止肌腱外源性愈合，促进内源性愈合，提高了肌腱愈合质量，为早期主动功能训练提供了必要条件。
[关键词]肌腱病；羊膜；模型，动物
doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2018.01.008
肌腱损伤是临床手外科常见的疾病，Ⅱ区肌腱损伤后肌腱粘连是肌腱损伤后常见的并发症，预防肌腱粘连是肌腱损伤治疗过程中一大难题[1]。国内外学者通过改进肌腱缝合方法一方面减轻了肌腱粘连，另一方面为早期主动活动提供了维持肌腱断端抗张力。早期主动训练可有效预防肌腱粘连，促进肌腱愈合越来越受到广大学者的重视[2-3]。本研究应用来亨鸡趾屈肌腱及腱鞘损伤模型，肌腱缝合后用羊膜重建腱鞘缺损，通过生物学检测方法，探讨屈肌腱损伤修复术后早期生物力学特征，旨在为临床肌腱及腱鞘损伤修复提供理论指导。
1.1冻干羊膜的制备及保存 冻干羊膜由河北医科大学第三医院产科提供，经产妇同意且经免疫学检查排除HBV、HCV、梅毒、淋病及HIV等传染病，无菌下取下胎膜，用PBS液冲洗净胎膜上的血凝块，放置于改良的PBS液中，在洁净工作台上钝性剥离获取羊膜，抗生素氯化钠溶液浸泡羊膜20 min，上皮细胞层朝上将羊膜平铺于消毒过的滤纸上，将其剪成50 mm×50 mm大小备用，用25%氯化钠溶液洗涤羊膜10 min，将羊膜浸泡于10%氯化钠溶液(含有2%冷冻保护液)，置于-10 ℃低温保存72～96 h，再将羊膜置于10%氯化钠溶液中浸泡5 min，以-2 ℃/min的速度冷冻快速降至-70 ℃，-70 ℃维持1 h后,以2 ℃/min速度升温至42 ℃,持续真空干燥至4 h，塑料盒密闭封存，常温保存。
1.2实验动物及方法 实验动物为6月龄健康雄性来亨鸡44只，体质量(2.06±0.50) kg，由河北省实验动物中心提供，将40只来亨鸡随机分组为实验组与对照组，每组20只。 选用来亨鸡双足第Ⅲ足趾肌腱及腱鞘损伤模型。应用盐酸氯胺酮注射液(10 mg/kg)及地西泮注射液(0.5 mg/kg)于来亨鸡大腿部肌肉注射，常规消毒铺单，于双侧第Ⅲ足趾跖侧面近位趾间关节处作皮肤切口，暴露腱鞘，切除腱鞘组织1.0 cm及趾浅屈肌腱，切断趾深屈肌腱,用5-0强生普理灵缝合线作改良kessler中心缝合，用7-0强生普理灵缝合线作周边缝合。实验组采用两层羊膜覆盖腱鞘缺损处，上皮细胞层朝向肌腱侧，用7-0强生普理灵缝合线缝合固定，用4-0缝合线间断缝合皮肤伤口，消毒后无菌纱布包扎，拳击手套包扎法固定双足于屈曲位，3周后去除双足固定自由活动。对照组除对腱鞘不进行修复，余治疗与实验组相同。
1.3检测方法 分别于术后1、2、3、4周每组随机选取5只实验动物，自第Ⅲ跖趾关节处离断，且保留近侧长段趾深屈肌腱，进行生物力学测试。
1.3.1肌腱最大拉伸断裂强度 保留第Ⅲ足趾趾深屈肌腱及远节趾骨，分离趾深屈肌腱与其他组织，将趾深屈肌腱断端及远节趾骨分别固定于生物力学测试仪(BOSE公司生产ElectroForce3520生物力学试验机，美国)两端夹具上，以拉伸速度为20 mm/min拉伸肌腱，最大负荷为200 N，牵拉至肌腱吻合口断裂并记录测量值。
1.3.2拉断肌腱粘连带功耗 分别将第Ⅲ足趾趾深屈肌腱断端及近节趾骨固定于生物力学测试仪的两端夹具上，趾间关节呈伸直位，垂直于水平面，于趾深屈肌腱出鞘管处用缝线作为标记，以拉伸速度为20 mm/min拉伸肌腱，最大负荷为100 N。每个标本测试2次，用游标卡尺测量趾深屈肌腱拉出鞘管的长度,第1次肌腱向近端滑动15 mm时停止牵拉，与生物力学测试仪相连的计算机获得拉力-位移曲线，曲线下面积为此次拉伸15 mm时的功耗(W1)；将标本复原，再次牵拉15 mm时，读取计算机此次拉伸15 mm的功耗(W2)。计算拉断肌腱粘连带功耗= W1-W2。
1.4统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件分析数据。计量资料比较分别采用独立样本的t检验、F检验和SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1肌腱最大拉伸断裂强度 所有实验动物存活至实验结束，伤口愈合良好。2组均在2周时最大拉伸断裂强度下降，3周和4周时逐渐升高，术后1、2、3、4周各个时点实验组肌腱最大拉伸断裂强度均大于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。
表12组不同时间点肌腱最大拉伸断裂强度比较
Table1Comparisonofmaximumtensilefracturestrengthof2groupsoftendonsatdifferenttimepoints
*P<0.05与1周比较 #P<0.05与2周比较 △P<0.05 与3周比较(SNK-q检验)
2.2拉断肌腱粘连带功耗 术后1、2、3、4周，2组拉断肌腱粘连带功耗均呈逐渐升高趋势，实验组每个时点拉断肌腱粘连带功耗均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。
表22组不同时间点拉断肌腱粘连带功耗比较
Table2Comparisonofthepowerconsumptionof2groupsofbrokentendonadhesivebandsatdifferenttimepoints
*P<0.05与1周比较 #P<0.05与2周比较(SNK-q检验)
肌腱损伤约占临床手外伤的30%。肌腱损伤修复后肌腱粘连严重影响手部功能，给社会和家庭生活造成沉重的负担[4]。肌腱损伤修复过程伴随各类因子的释放和参与，其愈合机制分为内源性愈合和外源性愈合。外源性愈合是指肌腱周围组织的成纤维细胞和毛细血管，在肌腱断裂缝接后侵入断端并增殖，合成分泌胶原。内源性愈合是指肌腱断裂缝合后，肌腱的腱外膜、腱内膜参与修复过程。肌腱损伤修复过程是外源性愈合和内源性愈合共同作用的，外源性愈合使肌腱断端与周围组织的组织粘连,内源性愈合则主要促进肌腱断端的愈合[5-7]。因此，促进内源性愈合及控制外源性愈合是减轻肌腱粘连的重要手段。
许多学者在促进内源性愈合及控制外源性愈合方面进行了一系列基础及临床研究并取得了一定的效果[8-9]。盛加根等[10]在肌腱损伤处应用外源性碱性成纤维生长因子，能促进肌腱愈合，但是加重了肌腱粘连。碱性成纤维生长因子促进成纤维细胞分泌胶原酶，诱导血管形成、成纤维细胞增值，合成胶原并细胞外基质沉积等，但碱性成纤维生长因子作为生长因子易被蛋白水解酶水解而失效，使其作用时效受限。盛加根等[11]在肌腱损伤处单次应用碱性成纤维生长因子及5-氟尿嘧啶，促进了肌腱愈合同时减轻了肌腱粘连。5-氟尿嘧啶使腱周组织中成纤维细胞及胶原纤维含量低，阻止了肌腱粘连发生[12-13]。耿震等[14]涂抹富血小板血浆于兔跟腱两断端后缝合，促进了损伤肌腱的愈合。血小板激活后释放血小板衍生生长因子、转化生长因子β1、胰岛素样生长因子1及血管内皮生长因子等多种生长因子，这些生长因子具有促进细胞增殖、胶原合成分泌及炎性趋化等[15-16]。黄启顺等[17]应用聚-DL-乳酸可吸收性防粘连膜预防肌腱粘连，达到既不影响内源性愈合又能阻止外源性愈合的目的。有学者采用自体脂肪颗粒纯化、腱周膜及移植修复腱鞘，具有良好的生物相容性，有效阻止术后肌腱粘连，改善肌腱滑动的作用[18-19]。Jiang等[20]应用静电纺丝技术制作多层生物膜，重建腱鞘缺损，促进肌腱滑动及预防肌腱粘连，取得了满意效果。这些措施均是单一从促进内源性愈合或阻止外源性愈合方面的研究，但随着组织工程技术的进步，构建了组织工程化腱鞘，既能促进内源性愈合又能阻止外源性愈合。徐梁等[21]将自体滑膜细胞接种于PGA支架上，构建出组织工程化腱鞘，与正常腱鞘组织类似，腱鞘内表面光滑，腱鞘与肌腱之间有明显间隙，有效预防了肌腱粘连。Baymurat等[22]构建负载滑膜细胞的组织工程腱鞘修复腱鞘缺损，滑膜细胞分泌胶原基质及透明质酸钠可起到促进肌腱愈合及预防肌腱粘连的作用。组织工程腱鞘预防肌腱粘连具有重要意义，但是其准备时间较长，体内肌腱已愈合并产生粘连，且腱鞘细胞来源有限，从而限制了组织工程肌腱的临床应用。新鲜羊膜由上皮细胞层、基底膜、致密层、纤维母细胞层和海绵层构成，上皮细胞层含有羊膜上皮细胞和由其分泌的多种细胞因子，人羊膜间充质干细胞具有干细胞特性，在合适的条件下可诱导及分化成多种细胞[23-24]。新鲜羊膜保存时间较短，需在24 h内应用。本研究采用华萍等[25]冷冻干燥法处理新鲜羊膜制成冻干羊膜,其具有的组织形态及生物活性因子与新鲜羊膜无明显差异。生物力学检测结果显示，实验组1、2、3、4周最大拉伸断裂强度和拉断肌腱粘连带功耗均低于对照组，说明冻干羊膜促进了肌腱愈合，减轻了肌腱粘连。推测机制可能为：①作为机械屏障作用使肌腱与周围组织隔开，阻止腱周结蹄组织长入；②上皮细胞层含有的细胞因子具有抑制炎症反应，减少瘢痕形成；③细胞因子促进肌腱细胞增殖及分泌胶原纤维；④无血管基质可防止瘢痕组织过度形成；⑤羊膜作为半透膜利于营养物质交换，促进肌腱内源性愈合。
肌腱断裂损伤修复术后，由于局部组织坏死、炎症反应等加速局部细胞凋亡，在早期凋亡指数(凋亡细胞/总细胞)持续上升，3 d可达最高峰，持续1周左右凋亡指数均超过40%，随后逐渐下降，于术后3周达到低点，但仍高于正常肌腱的凋亡指数；细胞凋亡高峰过后，当细胞凋亡呈下降趋势时，增殖细胞逐渐增多，开启损伤肌腱修复阶段，并在术后2周左右达到高峰，术后3周后增殖速度下降，术后4周仍高于正常水平[26-27]。在凋亡和增殖期高峰之间的这段时间(肌腱修复术后1～2周)是肌腱最脆弱的时期。本研究2组最大拉伸断裂强度在术后1～2周呈降低，实验组术后3周显著提高，对照组术后1～4周均低于实验组。推测机制可能为：冻干羊膜能抑制细胞凋亡，促进细胞增殖，增强肌腱断端愈合的强度。为早期功能训练提供了有利的条件。
冻干羊膜重建腱鞘可促进肌腱内源性愈合，增强肌腱断端愈合的强度；控制了外源性愈合，减少了肌腱粘连，减轻了肌腱主动活动时的阻力，利于早期主动功能训练。主动功能训练又可改善细胞周围营养成分及氧含量；促进肌腱细胞增殖、合成DNA和蛋白质；增加胶原和细胞外基质网合成，使肌腱胶原纤维排列有序，提高了肌腱抗拉强度[28-30]。综上所述，冻干羊膜重建腱鞘缺损为临床促进肌腱愈合及减轻肌腱粘连提供了新方法及理论基础。
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BAI Jiang-bo, ZHAO Hong-fang, ZHANG Bing, YU Kun-lun, MA Tao, TIAN De-hu*
(DepartmentofHandSurgery,theThirdHospitalofHebeiMedicalUniversity,KeyLaboratoryofOrthopedicsBiomechanicsofHebeiProvince,Shijiazhuang050051,China)
[Abstract]ObjectiveTo explore the biomechanical characteristics of tendon healing and tendon adhesion after the freeze-dried amniotic membrane was used to reconstruct tendon sheath defect.MethodsForty healthy male leghorn chickens were used in this study. These animal models were randomly divided into two groups, the therapy group and the control group, with twenty chickens in each group. The model of tendon injury and tendon sheath defects was established in the third toes of chicken. After repairation of the flexor digitorum profundus tendon, a double freeze-dried amniotic membrane was used to reconstruct the tendon sheath defect of model in the therapy group, while the tendon sheath defect was not reconstructed in the control group. Five chickens were randomly selected from each group at the 1st, 2nd, 3rd and 4th week for biomechanical analysis. Biomechanical parameters, including the tensile strength of rupture and the tensile adhesion strength of the rupture zone were measured at each time point.ResultsAll experimental animals survived until the experiment was finished, and all incision healed well. The tensile strength of rupture decreased after the first two weeks, and increased gradually at the 3rd and 4th week. At the 1st, 2nd, 3rd and 4th week after the operation, the tensile strength of rupture in the therapy group was significantly higher than that in the control group(P<0.05). The power consumption of the 2 groups was increased gradually at 1, 2, and 3,4 weeks. In the experimental group at 1, 2,3,4 weeks, the power consumption of the tendon adhesion zone was lower than that of the control group. The differences are statistically significant(P<0.05).ConclusionReconstruction of tendon sheath defects by freeze dried amniotic membrane can prevent tendon from exogenous healing, promote endogenous healing, and improve the quality of tendon healing, which provides a necessary condition for early active functional training.
[Key words]tendinopathy; amnion； models, animal
[收稿日期]2017-06-14；
[修回日期]2017-09-26
[基金项目]河北省医学科学研究重点课题(ZL20140210)
[作者简介]白江博(1982-)，男，河北武安人，河北医科大学第三医院主治医师，医学硕士，从事手外科疾病诊治研究。
*通讯作者。 E-mail:tiandehu899@163.com
[中图分类号]R686.1
[文献标志码]A
[文章编号]1007-3205(2018)01-0034-05
(本文编辑：许卓文)