近年来，寻求安全、经济、有效的药物治疗糖尿病性视网膜病变已成为众多学者研究的热点。二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)是人体正常饮食中不可缺少的不饱和脂肪酸，浓度≥0.15 g/L时，可抑制体外培养的人血管内皮细胞增殖。联合注药法建立的增殖型糖尿病性视网膜病变(proliferative diabetic rentinopathy，PDR)动物模型能够代表人类PDR。EPA 体内应用可以减轻糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)背景期病变，阻止增殖性血管病变发生，对视网膜神经细胞有保护作用。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、flk-1、bax、bcl-2在DR视网膜组织中的表达变化与DR关系密切。本研究观察EPA治疗后DR大鼠视网膜组织中VEGF、flk-1、bax、bcl-2的表达，报告如下。
1 材 料 与 方 法
1.1实验动物与主要试剂 8周龄清洁级健康SD大鼠，雌雄各半，180～250 g。购自河北省实验动物中心。VEGF蛋白购自美国Sigma公司；VEGF、flk-1、bax、bcl-2一抗购自博士德公司；PV-6001/6002免疫组织化学试剂盒购自北京中杉公司。
1.2方法 链脲佐菌素(streptozocin，STZ)60 mg/kg腹腔注射制备SD大鼠糖尿病模型[1]共36只，随机分为4组：C组12只成模后1个月VEGF(0.05 μg)双眼玻璃体注射；D组12只成模后1个月VEGF(0.05 μg)+EPA(0.5 μg)双眼玻璃体注射；E组8只成模后1个月VEGF(0.05 μg)双眼玻璃体注射，2周后EPA(0.5 μg)双眼玻璃体注射；F组4只成模后1个月VEGF(0.05 μg)双眼玻璃体注射，4周后EPA(0.5 μg)双眼玻璃体注射。
1.3取材 VEGF注射后2周、4周、8周分别处死每组各4只动物制作视网膜切片。行免疫组织化学染色，应用MIAS1998型图像分析系统(河北医科大学第三医院实验中心)测定VEGF、flk-1、bax、bcl-2在节细胞层、内网层的平均光密度值，观察视网膜节细胞层和视网膜内网层VEGF、flk-1、bax、bcl-2的表达。
1.4统计学方法 应用SPSS 13.0统计软件分析数据，计量资料比较分别采用t检验、F检验及SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1VEGF的表达
2.1.1光学显微镜观察 C组VEGF在视网膜除视杆视锥层外节之外的各层均有表达，节细胞层和神经纤维层表达最强，其次为Müller细胞(图1)。D、E、F组大鼠视网膜VEGF表达阳性部位均与C组相同。D组注射2周后视网膜层VEGF的表达强度较C组注射2周后VEGF的表达强度弱(图2)，D组注射4周后除内网层以外表达强度较C组注射4周后弱，D组注射8周后内网层表达强度较C组注射8周后增强；E组注射4周后表达强度较C组明显减弱(图3)，E组注射8周后则无明显改变；F组注射8周后内网层表达较C组注射8周后组增强(图4)。
2.1.2各组视网膜节细胞层和内网层VEGF的表达 在视网膜节细胞层，注射2周时D组VEGF的表达强度低于C组，注射4周时D组和E组VEGF的表达强度均低于C组，注射8周时D组VEGF的表达强度高于C组，E组和F组VEGF的表达强度均低于D组，差异有统计学意义(P<0.05)；在视网膜内网层，注射2周时D组VEGF的表达强度低于C组，注射4周时D组和E组VEGF的表达强度均低于C组、E组又低于D组，注射8周时D组和F组VEGF的表达强度均高于C组、F组VEGF的表达强度高于E组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。
表1 各组大鼠视网膜节细胞层和视网膜内网层的VEGF光密度值
Table1Optical density value of VEGF expression in ganglion cell layer and in IPL in each group 
值)
*P<0.05与C组比较 #P<0.05与D组比较 △P<0.05与E组比较(SNK-q检验)
2.2flk-1的表达
2.2.1光学显微镜观察 C组、D组、E组、F组flk-1在视网膜除视杆视锥层外节之外的各层均有表达(图5，6)。D组注射2周后表达强度与C组注射2周后比较无明显变化；D组注射4周后节细胞层表达强度与C组注射4周后比较略有增强(图6)；D组注射8周后表达强度与C组注射8周后比较明显减弱(图7)。E组、F组表达强度与C组比较明显减弱(图8，9)。
2.2.2各组视网膜节细胞层和内网层flk-1的表达 在视网膜节细胞层，注射2周时C组与D组flk-1的表达强度差异无统计学意义(P>0.05),注射4周时D组flk-1的表达强度高于C组和E组，E组flk-1的表达强度低于C组和D组，注射8周时D组、E组和F组flk-1的表达强度均低于C组，E组flk-1的表达强度低于D组和F组，差异有统计学意义(P<0.05)；在视网膜内网层，注射2周时C组与D组flk-1的表达强度差异无统计学意义(P>0.05),注射4周时D组flk-1的表达强度高于C组，E组flk-1的表达强度低于C组和D组，注射8周时D组、E组和F组flk-1的表达强度均低于C组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。
表2 各组大鼠视网膜节细胞层和视网膜内网层的flk-1光密度值
Table2Optical density value of flk-1expression in ganglion cell layer and in IPL in each group 值)
*P<0.05与C组比较 #P<0.05与D组比较 △P<0.05与E组比较(SNK-q检验)
2.3bax的表达
2.3.1光学显微镜观察 C组、D组、E组、F组bax在视网膜除视杆视锥外节之外的各层均有表达,其中属神经节细胞层和神经纤维层的表达最强(图10，11)，但D组较C组各层表达强度均减弱(图11)；E组注射4周后在内网层的表达强度减弱，其余各层无明显变化；E组注射8周后在各层表达强度均有所减弱；F组表达强度在各层均减弱。
2.3.2各组视网膜节细胞层和内网层bax的表达 在视网膜节细胞层，注射2周时D组bax的表达强度低于C组,注射4周时D组的bax表达强度低于C组，E组bax的表达强度高于D组和C组，注射8周时D组、E组和F组bax的表达强度均低于C组，E组和F组的bax表达强度均高于D组，F组又高于E组，差异有统计学意义(P<0.05)；在视网膜内网层，注射2周时D组bax的表达强度低于C组,注射4周时D组和E组bax的表达强度低于C组，注射8周时D组、E组和F组的bax表达强度均低于C组，E组和F组的bax表达强度均高于D组，F组高于E组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。
表3 各组大鼠视网膜节细胞层和视网膜内网层的bax光密度值
Table3Optical density value of bax expression in ganglion cell layer and in IPL in each group 值)
*P<0.05与C组比较 #P<0.05与D组比较 △P<0.05与E组比较(SNK-q检验)
2.4bcl-2的表达
2.4.1光学显微镜观察 C组bcl-2在视网膜除视杆视锥层外节之外的各层均有表达,C组注射2周后在节细胞层和神经纤维层的表达阳性程度明显强于其他各组；D组注射2周后各层阳性程度均较C组减弱(图12)，D组注射4周、8周后仅在内网层表达强度减弱；E组在内网层的表达强度减弱；F组在各层表达强度均减弱。
2.4.2各组视网膜节细胞层和内网层bcl-2的表达 在视网膜节细胞层，注射2周时D组bcl-2的表达强度低于C组,注射4周时E组的bcl-2表达强度低于C组，注射8周时D组和F组的bcl-2表达强度均低于C组；在视网膜内网层，注射2周时D组的bcl-2表达强度低于C组，注射4周时D组和E组的bcl-2表达强度均低于C组，E组高于D组，注射8周时D组、E组和F组的bcl-2表达强度均低于C组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。
表4 各组大鼠视网膜节细胞层和视网膜内网层的bcl-2光密度值
Table4Optical density value of bcl-2expression in ganglion cell layer and in IPL in each group 值)
*P<0.05与C组比较 #P<0.05与D组比较 △P<0.05，与E组比较(SNK-q检验)
3 讨 论
3.1VEGF和flk-1表达的变化 VEGF是DR微血管病变的重要因子。大量研究表明，糖尿病时VEGF在视网膜的表达明显高于正常且随病程进展渐增，特异性酪氨酸激酶受体flk-1表达也随病程渐增强[2-5]。前期研究联合用药诱发的PDR大鼠模型视网膜组织VEGF及flk-1表达变化支持上述观点，并证实在背景期和增殖前期进行EPA玻璃体注射可以阻止增殖性血管病变发生[6]。为进一步明确EPA治疗PDR的机制，本研究对EPA治疗组大鼠视网膜组织VEGF和flk-1表达进行了免疫组织化学分析。
本研究显示，背景期治疗后2周、4周，增殖前期治疗后2周时节细胞层VEGF表达较对照组减弱；背景期、增殖前期治疗后2周时内网层VEGF表达较对照组减弱；背景期治疗后8周、增殖期治疗后4周时内网层VEGF表达较对照组增强。说明背景期治疗后4周内和增殖前期治疗后2周内视网膜内层VEGF表达减弱，阻止了PDR发生；而EPA治疗后8周对VEGF的影响作用消失，增殖期给药对抑制VEGF表达无效。
本研究显示，flk-1表达增强出现在注射VEGF后2周、8周，背景期治疗组2周、8周，增殖前期治疗组4周、8周时节细胞层flk-1的表达较对照组减弱。说明EPA在背景期、增殖前期给药后2周可有效抑制flk-1表达，从而抑制VEGF与受体结合发挥作用。背景期治疗组4周时表达增强，用EPA是受体封闭剂难以解释，具体机制尚待研究。病程发展到8周时flk-1表达较对照组减弱，8周时背景期、增殖前期、增殖期治疗组内网层VEGF表达均较对照组减弱。说明在任何期给予EPA治疗后，8周病程时内网层flk-1的表达均减弱，VEGF发挥作用受抑制。
3.2促凋亡基因bax和抑凋亡基因bcl-2表达的变化 bcl-2基因可保护视网膜神经细胞，抑制其凋亡[7-8]。bax是bcl-2的同种性蛋白，作用相反，二者之间的比例决定了细胞生存还是凋亡[9-10]。以往研究表明，bax在糖尿病大鼠[11-12]、和人[13]视网膜表达增加。bcl-2则存在争议：Drel等[14]发现，链脲佐菌素诱导的大鼠视网膜血管周细胞表达bcl-2降低；Wu等[15]和Han等[16]发现糖尿病患者的视网膜Muller细胞表达bcl-2降低；Shin等[17]则发现糖尿病患者神经视网膜表达bcl-2增加；Cai等[18]发现视网膜血管内皮细胞表达bcl-2先增加后降低。
本研究显示，联合注药组DR大鼠视网膜bax表达增加，随病程进展视网膜内层bcl-2表达增加，而外源性VEGF则在短期内使bcl-2表达增加。为明确EPA治疗PDR机制，本研究对EPA治疗组大鼠视网膜组织bax和bcl-2表达进行了免疫组织化学分析。
本研究显示，除增殖前期治疗后2周时内网层bax的表达与对照组比较无统计学意义外，其余各组节细胞层和内网层bax表达均较对照组减弱；当病程8周时背景期、增殖前期治疗组bax表达均较增殖期治疗组减弱。说明背景期与增殖前期治疗组相同DR病程状态下节细胞层和内网层bax的表达弱于增殖期治疗组。因此，EPA玻璃体注射8周内，可减弱bax在视网膜的表达抑制DR进展，背景期和增殖前期治疗效果优于增殖期，但机制待探讨。
本研究显示，背景期治疗后2周节细胞层和内网层bcl-2表达较对照组减弱。而前期研究结果发现注射VEGF 2周时bcl-2表达增强，由此可知EPA能下调VEGF引起的bcl-2高表达，可能机制是EPA封闭flk-1受体，阻止VEGF与之结合，抑制DR进展，机体代偿性bcl-2高表达减弱。背景期治疗后4周、增殖前期治疗后2周仅在内网层表达减弱，且背景期疗效更优。说明4周时背景期治疗对bcl-2表达的影响大于增殖前期治疗。增殖前期治疗后6周内网层bcl-2表达亦减弱，而背景期治疗后8周对bcl-2表达无影响，表明EPA体内给药6周时不再减弱bcl-2表达，对保护神经细胞免受损害有益。增殖期治疗后4周时节细胞层和内网层bcl-2表达均减弱。总之，EPA给药6周内，由于抑制DR进展，bcl-2在视网膜的代偿性高表达减弱，此作用8周时消失，bcl-2继续保护神经细胞，但机制待探讨；不仅如此,在8周时bax/bcl-2比值降低，可保护周细胞免缺失。(本文图见封三)
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