糖尿病性勃起功能障碍(diabetes-induced erection dysfunction,DIED)是糖尿病慢性并发症之一。受多种因素限制，男性糖尿病人群勃起功能障碍(erectile dysfunction,ED)的真实发病率无法精准的获知，但据粗略估计DIED已经严重影响世界35%～90%的男性患者的生活质量[1]。引起DIED的机制繁多复杂，现阶段多数治疗手段亦未达到预期效果。五味子是木兰科植物，利用现代分离、提取技术从中获得的有效成分五味子醇甲具有抗炎抗氧化、保肝、镇静催眠及降血糖等多种作用，对肾脏及生殖系统亦有保护作用[2-3]。有研究发现不同浓度的五味子醇甲提取物能够舒张已收缩的阴茎海绵体平滑肌[4]。本研究通过腹腔注射链脲佐菌素(streptozocin,STZ)及皮下注射阿扑吗啡(apomorphine,APO)构建DIED大鼠模型，对五味子醇甲改善模型动物ED进行探讨。
1 材 料 与 方 法
1.1动物来源 健康无特定病原体(specefic pathogen free,SPF)8周龄雄性SD大鼠100只，体质量(200±20) g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证书编码：11400700153907。
1.2试剂及仪器 STZ、APO购自Sigma公司，五味子醇甲购自成都植标化生物技术有限公司，Life Scan血糖仪及配套血糖试纸购自中国上海强生公司，PowerLab数据采集分析系统购自埃德仪器国际贸易(上海)有限公司，Cobas 8000全自动生化分析仪购自美国LI-COR公司。
1.3实验方法
1.3.1建立DIED模型 参照文献建立DIED模型[5-6]。取100只8周龄雄性SPF级SD大鼠，自由饮食水，所有步骤均按照中国实验动物使用规则并取得河北医科大学伦理委员会批准。大鼠适应性饲养1周，注射STZ前禁食16 h，不禁水，其中88只大鼠腹腔注射STZ(60 mg/kg)，余12只不注射STZ仅注射柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，并作为正常对照组。注射STZ 72 h后断尾经尾静脉取血，应用血糖仪测定大鼠随机血糖，若随机血糖>16.7mmol/L则初步视为糖尿病大鼠，以后每周测血糖1次。若随机血糖有1次以上(包括1次)未达到16.7 mmol/L以上，则被剔除。经统计，腹腔注射STZ 72 h后有2只大鼠死亡，4只大鼠测随机血糖未达到16.7 mmol/L。2只大鼠在注射STZ后1周内出现血糖波动，但1周后恢复正常，不计为糖尿病大鼠，余80只糖尿病造模成功，饲养8周后对糖尿病大鼠进行ED模型筛选，饲养期间有8只大鼠死亡。DIED模型大鼠筛选参照Heaton等[6]的方法。称取大鼠体质量以后分别单只放进实验笼中，调节实验室内灯光，使其尽量昏暗，保证周围环境安静，令大鼠适应环境10 min。将配制而成的APO溶液以100 μg/kg注射于大鼠颈部松软皮肤下，应用摄像机观察大鼠处于灯光昏暗、安静环境中的状态，时间为30 min；若出现龟头充血、表露，包皮后退并且阴茎膨粗、增长计为勃起1次。30 min未见勃起被认为是DIED大鼠。经筛选后共计35只DIED模型大鼠造模成功。
1.3.2实验分组及注射药物 从35只DIED模型大鼠中随机抽取32只分成4组，每组8只，分别作为五味子醇甲低剂量组(5 mg·kg-1·d-1)、五味子中剂量组(10 mg·kg-1·d-1)、五味子高剂量组(20 mg·kg-1·d-1)和DIED组；其余37只糖尿病大鼠、12只正常对照大鼠，从中分别随机抽取8只入糖尿病对照组及正常对照组；剩余所有未入实验组大鼠正常饲养。正常对照组、糖尿病对照组和DIED组等量的生理盐水灌胃给药，每日1次，周期为8周，治疗8周后统一进行阴茎海绵体内压(intracavernosal pressure,ICP)与平均动脉压(mean arterial pressure,MAP)比值测定，其后处死动物并留取血及组织标本。
1.4结果判定
1.4.1血糖与体质量的测定 每周测量1次血糖和体质量，观察各组大鼠毛色、尿量及行为。
1.4.2ICP/MAP比值测定 参照文献测定大鼠的勃起功能[7-8]。用10%的水合氯醛腹腔注射(0.3 mL/100 g)麻醉SD大鼠。充分暴露大鼠左侧颈总动脉，将充满肝素的细塑料插管插入颈总动脉后连接PE-50管，与PowerLab数据采集分析系统连接，记录MAP。于大鼠下腹部正中开纵行切口，充分暴露前列腺一侧叶背面，钝性分离，显露出骨盆神经节和海绵体神经。以铂金制双极电极勾(两电极直径均约0.2 mm)勾住海绵体神经并将其固定(两电极勿接触，间距约1 mm)连接到PowerLab数据采集分析系统的电源上。解剖阴茎背面附近皮肤和筋膜，显露阴茎海绵体至根部。用7号针连接到1个充满肝素的PE-50管上，将针头插入一侧海绵体阴茎根部，深度1～2 mm，PE-50管连接到PowerLab数据采集分析系统。电极刺激强度设置为频率20 Hz，脉冲宽度2 ms，刺激电压10 V，记录海绵体基础压后测量ICP；刺激1 min，休息5 min，再进行下一次刺激。记录最高ICP，最高ICP/MAP比值作为评估勃起功能的指标。
1.4.3大鼠实验指标的检测 五味子醇甲治疗8周后，且在测量大鼠的ICP/MAP后，用手术剪剥离暴露下腔静脉取血送检，血样放置于标准生化促凝管中离心，取血清室温静置，待测。采集的血液标本送至河北医科大学第二医院生化检验室，应用德国罗氏公司的Cobas 8000全自动生化分析仪检测血液中的丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferse,ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、血清肌酐(serum creatinine,SCr)。
1.5统计学方法 应用SPSS 23.0软件处理数据，计量资料比较分别采用成组设计的t检验、配对t检验、F检验和SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1正常对照组与糖尿病组大鼠体质量和血糖改变 造模8周后即注射APO前，与正常对照组相比，糖尿病组大鼠体质量明显下降，血糖显著上升(P<0.05)，见表1。
血糖水平比较
Table1Comparison of body mass and blood glucose levelbetween the normal control group andthe diabetes mellitas group
2.2各组大鼠治疗前后体质量和血糖变化 治疗前糖尿病对照组、DIED组、低剂量、中剂量和高剂量药物组大鼠体质量均较正常对照组明显下降，血糖较正常对照组明显上升(P<0.05)；除正常对照组外的其余各组间两两比较，大鼠体质量及血糖差异均无统计学意义(P>0.05)。治疗8周后，糖尿病对照组、DIED组、低剂量、中剂量和高剂量药物组大鼠体质量均较治疗前明显下降(P<0.05)；除正常对照组外的其余各组间两两比较，大鼠体质量及血糖差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。
Table2Changes of body mass and blood glucose in each group of rats before and after treatment
*P<0.05与正常对照组比较(SNK-q检验) aP<0.05与治疗前比较(配对t检验)
2.3电刺激大鼠阴茎海绵体神经后ICP及ICP/MAP改变 刺激阴茎海绵体神经后正常对照组和糖尿病对照组ICP迅速升高，后ICP升高进入平台期，而DIED组和低剂量药物组则变化不大，中剂量药物组和高剂量药物组ICP明显升高，但仍低于正常对照组和糖尿病对照组(P<0.05)，停止刺激后ICP下降至刺激前基础压力；各组间MAP差异无统计学意义(P>0.05);各组间ICP/MAP比值从减低到升高，其差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。
Table3Changes of ICP and ICP/MAP in rats after electrical stimulation of the cavernous nerve
*P<0.05与正常对照组比较 #P<0.05与糖尿病对照组比较 △P<0.05与DIED组比较 ☆P<0.05与低剂量药物组比较 ▲P<0.05与中剂量药物组比较(SNK-q检验)
2.4各组大鼠ALT、AST、ALP和SCr水平比较 各组大鼠肝功能指标ALT、AST、ALP和肾功能指标SCr有轻微上下波动，但组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表4。
Table4ALT,AST,ALP and SCr levels in rats of each group
3 讨 论
国际糖尿病联盟的最新调查结果显示，2014年全世界已有3.87亿糖尿病患者，其中中国为糖尿病高发国家之一，数据显示我国糖尿病总体发病率已达11.6%[9]。DIED是男性糖尿病患者主要并发症之一[10]。
研究发现，32%的1型糖尿病患者和46%的2型糖尿病患者有ED，超过50%的男性糖尿病患者会在10年内出现ED症状[11]。这给患者的身心健康及众多家庭的稳定造成不良影响。DIED发病机制复杂，涉及多种因素相互作用，基本归纳为血管病变因素、神经病变因素、阴茎海绵体平滑肌因素、神经递质调节、内分泌紊乱因素及社会心理因素6个方面[12]。日常临床诊疗中，及早检出并有效医治DIED对于改善预后、提高生活质量有着积极意义。
目前，临床上有多种治疗ED的方法，一线治疗药物为5型磷酸二酯酶抑制剂，其治疗的有效率为70%，但不能根治ED仍是一大缺陷。而其他包括向海绵体内注射血管活性物质、手术治疗、真空负压吸引和阴茎假体植入术等多种治疗手段因为有较严重的不良反应并不为多数患者所接受[12-15]。因此，开发针对DIED的口服新药物是当前临床治疗的迫切需求，也具有十分广阔的市场前景。
五味子为木兰科植物五味子的干燥成熟果实。据《本经》和《本经备要》记载，五味子“酸温而润，收涩之中兼具补益作用，上能敛肺，下能固肾，外可止汗，内又益气”，故具有“敛肺滋肾，生津敛汗，涩精止泻，宁心安神”之功效，药用价值极高。利用分离、提纯技术从中得到的五味子醇甲作为主要起效部分已被研究多年。五味子醇甲具有保肝益肾、保护心脑血管、镇静、催眠、保护脑神经细胞、增强心血管功能、抗衰老、增强免疫、抑制肿瘤细胞生长、促进精子发生等多种功能[2-3,14,16]。有研究表明，五味子提取物在离体实验中能够引起家兔阴茎海绵体浓度依赖性舒张，显著提高组织内cGMP浓度，上调eNOS表达活性，对于内皮细胞功能紊乱具有一定的修复作用[4]。进一步研究证实，其中起关键作用的单体成分为五味子醇甲。结合本实验，建立DIED大鼠模型后，灌胃给予不同剂量的五味子醇甲，电生理检测各组大鼠ICP/MAP的改变，结果发现与单纯DIED组相比，低剂量组五味子醇甲组大鼠的ICP/MAP未见明显变化，而中、高剂量组ICP/MAP均有升高，且升高程度与药物剂量呈一定的正相关，高剂量药物组效果显著优于中剂量组。表明五味子醇甲能够改善DIED大鼠勃起功能。同时测定大鼠肝肾功能相关指标后发现，低、中、高剂量的五味子醇甲灌胃8周并未对SD大鼠肝肾功能造成不良影响，这初步肯定了药物的安全性。但由于实验条件的限制，并未设置其他剂量组，高剂量药物组(即20 mg·kg-1·d-1)是否为药物安全范围内最大效能浓度，有待后续研究证实。另外，实验未检测其他生化及血液指标以确立药物安全性，有待进一步完善。
尽管本实验存在许多不足之处，但仍旧为治疗DIED提供了新的思路。本课题组正在进行关于五味子醇甲通过何种机制改善勃起功能的研究，有望为该药的临床应用提供更多的理论依据。
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