血清miRNAs检测在肝癌中的临床应用价值

肝细胞癌(以下简称肝癌)是一种恶性程度极高的肿瘤疾病，其患病率和病死率逐年上升。我国是肝癌发病率最高的国家。目前肝癌上升为全球第六大最常见的癌症，是癌症相关死亡的第二个最常见原因[1]。有数据表明，全球范围内每年约有78万新发肝癌患者和74万死亡患者，近1/2发生在我国[2]。全球肝癌主要危险因素为慢性乙型肝炎或丙型肝炎病毒感染[3]。据资料不完全统计，全球世界人口中近5%长期感染乙型肝炎病毒(约3.5亿人)[4]。丙型肝炎病毒的全球患病率约为2%，意味着近1.8亿人持续携带这种病原体[5]。此外，肝癌其他危险因素还有肥胖、糖尿病、维生素D缺乏、黄曲霉毒素B1、酒精性和非酒精性肝硬化等[6]。现在肝癌诊断主要依靠影像学与血清肿瘤标记物甲胎蛋白(afalpha fetoprotein，AFP)，但是其敏感度低，确诊时患者多已发展至肝癌中晚期，总体预后差。小分子RNA(microRNA，miRNAs)是一类内源性的非编码小RNA，其高度保守，参与细胞生长、分化、代谢、凋亡及肿瘤发生发展，并且在血清及组织中稳定存在。近年来越来越多研究表明，miRNAs的异常表达与肝癌的发生发展密切相关，血清miRNAs在肝癌诊断和预后评估中具有广阔应用前景。现简要阐述血清miRNAs在肝癌检测、诊断及预后方面的临床应用意义。

1 肝癌目前的诊治现状

目前诊断肝癌主要依据AFP值或其动态演变，以及超声(ultrasonography，US)、计算机断层扫描(computed tomography，CT)、磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)表现。依靠AFP诊断肝癌的敏感度为40%～65%，特异度为76%～96%，仍有约1/3的肝癌患者被遗漏而无法早期确诊[7]。最近一项JSH指南提出，联合使用肿瘤标记物(AFP>200 μg/L，AFP-L3>15%,或去γ-羧基凝血酶原>40 mmol/L)诊断肝癌[8]。此外，通过对CT和MRI造影剂的对比研究发现，MRI诊断敏感度更高。MRI对各种大小结节性肝癌的敏感度为77%～100%，而CT为68%～91%，并且受病灶大小影响[9]。US作为最常用来监测的影像学检查，其诊断特异度高于90%，但是早期诊断肝癌的敏感度低，与CT、MRI相比，US检测的费用较低，可定期重复选择，对人体无危害，但是易受诊断医师主观影响[10]。CT诊断费用较高，对患者具有一定的辐射。而MRI虽无辐射但诊断费用更高，难以成为常规定期筛查方式。

随着肝癌发病率逐年增加，肝癌患者5年整体生存率低于5%[11]。目前手术切除原发灶是肝癌最有效益的治疗方式，术后患者5年总体生存率为38%～61%。尽管如此，仍有70%多肝癌患者不适合接受手术[12]。除手术外，肝癌治疗方式还有肝动脉栓塞化疗(transcatheter arterial chemoembolization，TACE)、射频消融(radiofrequency ablation，RFA)、注射无水乙醇(anhydrous ethanolinjection，PEI)等。近期一项随机临床试验表明TACE联合RFA治疗肝癌5年总生存率为45.7%[13]。有数据表明，如果可以早期诊断肝癌，就能采取根治性治疗策略，如切除、肝移植或消融，患者5年生存率可高于50%[14]。因此，为了能进行肝癌早期筛查和诊断，寻找一种敏感度和特异度高、患者依从性好的血清学标志物成为目前研究的重要方向。

2 血清miRNAs在肝癌检测中的可行性

人类最早确认miRNAs是在1993年，当时Lee等[15]在研究秀丽隐杆线虫发育过程时发现了一种异时性基因lin-4。这种基因被证明是小分子非编码RNA(miRNA)。miRNAs是一类真核生物内源性的非编码小RNA，其高度保守，长度为19～25个核苷酸，参与生物许多调节过程(如细胞增殖、分化、新陈代谢、凋亡)及肿瘤的发生发展，且miRNAs具有抑癌和致癌双向调节功能[16]。一项研究探讨了miRNA-205、天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(cyserinlyaspartate-specificprotease,Caspase-3)表达水平对神经胶质瘤生物学行为的影响及其可能的作用机制，多数神经胶质瘤存在miRNA-205表达下调现象，而miRNA-205可能通过靶向调控Caspase-3影响胶质瘤细胞的侵袭、增殖、克隆[17]。miRNAs的双向调节作用说明其在肿瘤的生物学行为中发挥重要作用。

随着时间的推移，越来越多研究团队发现miRNAs在肝癌血清中异常表达，并且miRNAs在血清中的表达情况不尽相同。Chen等[18]研究显示，与健康对照组相比，肝癌患者血清miRNA-182和miRNA-331-3p水平显著升高，并且这种差异具有统计学意义。另外，Amr等[19]比较了肝癌组织、血液中miRNAs的表达及其用于肝癌早期检测的意义，肝癌患者血清、肿瘤组织中miRNA-21较对照组过度表达，而肝癌患者血清中miRNA-199a表达较慢性肝炎患者显著降低(P<0.01)，二者表达情况相反。这种血清miRNAs表达差异性为检测其在临床中的作用提供了基础。

miRNAs检测方法目前很多，常用的有荧光实时逆转录定量PCR(reverse transcription quantitative real-time PCR，RT-qPCR)、Northern blotting、miRNA微阵列/芯片等。

RT-qPCR是目前检测miRNAs的主要方法，被认为是定量检测miRNAs的金标准[20]。RT-qPCR结合了荧光定量及逆转录PCR的优点，与传统PCR相比敏感度和特异度更高，具有简便快速、成本低、自动化、可重复性等特点。但考虑miRNAs序列短，缺少poly(A)尾，且在提取miRNAs样品过程中会夹杂少许pri-miRNA或pre-miRNA等因素，人们设计出茎环引物RT-PCR、引物延伸RT-PCR、poly(A)加尾RT-PCR和miqPCR等检测方法[21]。

Northern blotting是最早用来检测miRNAs的方法,首先使用变性凝胶按照大小分离RNA，然后将其转移到尼龙膜上，利用标记的探针与目标基因进行互补杂交，然后干燥、暴露、分析，检测目的片段[22]。可以用来鉴定多个miRNAs大小及分子量显示，在miRNAs检测中扮演重要角色。Northern blotting采用LNA修饰的寡核苷酸探针较传统DNA寡核苷酸探针检测miRNA敏感度至少提高10倍[23]。Li等[24]改良成的液相Northern blot杂交，简便、快捷、准确、费用少；可使用多种荧光探针同时检测多种miRNAs。此方法不需要反转录，避免了逆转录过程中导致的误差；但是过程较长、步骤繁琐，可能会出现RNA的降解。

miRNA微阵列/芯片是分析miRNAs表达谱的标准方法，是一种高通量检测工具，广泛应用于基因组的研究，同时可检测多个miRNAs表达量。目前可用的miRNA微阵列平台有Agilent、Ambion、Exiqon、Invitrogen等。近年来，基因组测序的进展促进了新一代测序(next-generation sequencing，NGS)发展，大大提高了基因组测序速度。一项对比研究证实NGS可以识别微阵列分析无法检测的新的miRNAs，其在区分肝癌与非肿瘤组织方面具有较高的准确度(P=7.22×10-4,AUC=0.92)。NGS检测的miRNAs表达谱有望成为有用的诊断工具。除以上常用检测方法外，还有纳米技术定量检测、酶辅助miRNA定量检测及生物传感技术(如基于电化学检测)等[25]。

相关文献表明miRNAs在血液中不容易被内源性RNA酶降解，经反复冻融、低/高pH溶液处理后，血清miRNAs并未受到影响[26]。miRNAs在血液中稳定存在这一特性使血清miRNAs具有成为生物标记物可能。另外，采血为这一检验的实施提供了便利，较获取组织更易，患者更容易接受。种种研究表明，血清miRNAs检测成为可能，有望成为诊断肝癌及其病情监测的重要方法。

3 血清miRNAs检测在肝癌中的临床应用

miRNAs在肝癌患者血清中异常表达，或高或低，这种异常表达使其在肝癌临床应用中具有潜在的价值。

3.1通过检测血清miRNAs诊断肝癌 已往的研究发现，某些miRNAs的异常表达可以用于诊断肝癌，如miRNA-21。在Liao等[27]进行的一项Meta分析中，他们对血清miRNA-21诊断肝癌的潜在性能进行评估，结果显示与健康者相比，血清miRNA-21识别肝癌的敏感度为81.2%，特异度为84.8%，而区分肝癌与慢性肝炎患者的敏感度、特异度分别为62.4%、84.4%，较前相比低一些。这种差异性说明其在诊断肝癌方面具有一定潜能。

血清miRNAs异常表达的检测也许在早期肝癌诊断中可以发挥一定作用。Hung等[28]的研究探讨了循环miRNAs水平在早期肝癌诊断中的应用价值，结果显示血清miRNAs异常表达可以用于区分肝癌与慢性乙型病毒性肝炎或不典型增生结节，血清miRNA-122、let-7b与AFP具有相似的鉴别性能。

近年来，为进一步提高miRNAs临床诊断肝癌的敏感度及特异度，使其发挥更大价值，有学者开始探讨多个miRNAs联合检测诊断肝癌的准确度。Wen等[29]的研究显示，常州队列中4种标记物(miRNA-20a-5p、miRNA-320a、miRNA-324-3p和miRNA-375)，AUC=0.768，敏感度65%，特异度77.5%，可以作为肝癌的临床生物标志物；此外，8种miRNAs(miRNA-132-3p、miRNA-185-5p、miRNA-20a-5p、miRNA-25-3p、miRNA-30a-5p、miRNA-320a、miRNA-324-3p、miRNA-92a-3p)联合检测诊断肝癌的准确度较前明显提高，AUC=0.823，敏感度82.9%，特异度74%。同样，某研究团队研究了8种miRNAs(miRNA-206、miRNA-141-3p、miRNA-433-3p、miRNA-1228-5p、miRNA-199a-5p、miRNA-122-5p、miRNA-192-5p、miRNA-26a-5p)组合，得出了同样的结论[30]。以上研究表明，多种血清miRNAs结合，可进一步提高其诊断价值。

此外，相关文献显示血清miRNAs联合血清标记物AFP检测亦可使肝癌诊断的敏感度及特异度增加。如在一项回顾性研究中，在鉴别肝癌与对照组性能时，单独血清miRNA-29b(AUC=0.766)较miRNA-122(AUC=0.617)及miRNA-885-5p(AUC=0.63)高，以上3种联合(AUC=0.898)较单独鉴别能力高，这3种miRNAs联合AFP诊断准确度最高(AUC=1)。但在区分慢性丙型肝炎与肝癌时，血清miRNA-199a-3p(AUC=0.7)较miRNA-22(AUC=0.586)诊断性能高，而二者联合(AUC=0.668)诊断性能却较单独miRNA-199a-3p降低[31]。表明并不是任意miRNAs组合就可以增加诊断的准确度，故选择合适的miRNAs很有必要，但如何进行合理搭配需进一步阐述其中机制。

3.2通过检测血清miRNAs监测肝癌的发生发展 研究发现血清miRNAs不仅可以用来诊断肝癌，而且有可能用来监测肝癌的发生发展。Wang等[32]研究显示，与良性肝病组及健康受试组相比，血清miRNA-148a、miRNA-148b和miRNA-152在肝癌患者中明显下降；3种血清miRNAs动态监测数据与术前相比，术后miRNA-148、miRNA-152水平同步提高(P<0.05)，并且值得注意的是肝癌复发或转移患者与术后组相比，血清miRNA-148、miRNA-152显著下降(P<0.05)。表明动态检测血清miRNAs水平可评估患者术后状态，包括术后复发或转移情况并监测患者病情变化。

Ma等[33]在研究miRNA-129-5p抑制肝癌转移机制时，根据肝癌组织中miRNA-129-5p异常表达高低将肝癌患者分为2组(术前患者并未接受其他治疗)，术后随访30个月，并进行生存分析，结果表明肝癌组织中miRNA-129-5p低表达者与高表达者相比，前者发生血管侵袭、肝内转移和复发可能性更高(P<0.05)。也许监测并分析血清miRNA-129-5p可以监测肝癌发生发展。

3.3血清miRNAs在肝癌治疗方面发挥的作用 除上述临床应用价值外，miRNAs在治疗中亦扮演一份角色。其中，值得关注的是miRNAs也许可以作为肝癌治疗的靶点。Tang等[34]研究miRNA-155-3p与肝癌是否相关，结果显示肿瘤患者miRNA-155-3p高表达较miRNA-155-3p低表达者存活率显著下降(P<0.05)；同时，将从肝癌患者组织中提取的miRNA-155-3p皮下注入裸鼠侧腹，并于第28天将其处死，称量肿瘤组织，结果显示miRNA-155-3p低表达还可减少体内肿瘤发生(P<0.01)；通过实验证明miRNA-155-3p可以抑制FBXW7基因表达并降低FBXW7水平，从而促进肝癌发生。表明上调miRNA-155-3p有可能作为肝癌治疗的靶点。Jung等[35]进行的另一项动物实验研究了miRNA-148a对肝癌的作用，每周将含有miRNA-148a的脂质体腹腔注入含有癌组织的小鼠体内，6周后miRNA-148a治疗组肿瘤平均增长率明显低于安慰剂组。提示miRNA-148a对肝癌有治疗作用。

miRNAs有可能将在药物治疗肝癌中发挥一定作用。Cai等[36]进行一项体外实验研究miRNA-302b在5氟尿嘧啶作用于肝癌细胞株敏感性方面发挥的作用，结果表明miRNA-302b能够抑制肝癌细胞株增殖，并且miRNA-302b可能通过负向调节DPYD和抗凋亡蛋白mcl1增加肝癌对5氟尿嘧啶的敏感性，从而致细胞凋亡。说明miRNA-320b在药物治疗肝癌方面可以发挥正向作用。也许通过靶向作用于血清miRNA-320b可以进一步增加治疗效果。

3.4血清miRNAs检测在肝癌治疗后的预后价值 目前通过检测AFP、CT或MRI评价肝癌治疗后效果，或许miRNAs亦可以在此方面发挥作用。如血清miRNA-182和miRNA-331-3p的变化也许可以作为肝癌患者TACE术后治疗效果动态监测的有用指标。Chen等[18]团队对肝癌患者TACE术后血清miRNAs进行随访(治疗前和治疗后3～15 d、16～50 d、51～120 d)，发现肝癌患者TACE治疗后血清miRNA-182和miRNA-331-3p均低于治疗前，并且呈逐渐下降趋势。

Liu等[37]在一项回顾性研究中发现血清miRNA-200a、miRNA-21、miRNA-122、miRNA-224-5p与生存率显著相关；这4种血清miRNAs高表达组患者预后差而低表达组患者预后较好；多因素COX比例风险回归分析显示miRNA-200a表达是生存率的一项独立预后因素。表明miRNA-200a在预测肝癌预后方面具有潜在作用。另有研究显示，血清miRNA-210可作为预测原发性肝癌患者行肝动脉化疗栓塞治疗反应和预后的生物标志物[38]。

4 总结与展望

综上所述，血清miRNAs作为一种新的非侵入性的生物标志物备受关注，人们越来越多地关注其在临床上的应用并试图找寻其发挥的作用。虽然目前miRNAs与肝癌作用关系及机制尚未完全明确，但其在鉴别、诊断肝癌以及预测肝癌预后方面具有广阔的研究前景。随着分子生物技术发展，期待可以发现更加标准化的血清miRNAs检测技术，并且更加经济、便捷，使血清miRNAs在肝癌诊断、病情监测、治疗及预后、疗效评估预测等方面更加敏感特异，从而为医学研究进一步发展作出贡献。

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