我国丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染者约1 476.5万，居全球首位[1]。HCV感染慢性化可发生慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C，CHC)、肝硬化，甚至肝癌。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)与多种疾病有关[2-3]，其与CHC发生、进展及抗HCV疗效的关系是目前的研究热点[4-7]。辅助性T细胞17(T help cell-17，Th17)及其特征性细胞因子白细胞介素17(interleukin-17，IL-17)在CHC中的作用受到重视。IL-17 SNPs在CHC中的作用尚不明确。本研究比较携带IL-17 rs2275913及rs8193036位点不同基因型的CHC患者肝损伤程度，并分析两位点等位基因及基因型分布在不同HCV RNA水平患者之间的差异，旨在探讨IL-17 SNPs与CHC肝损伤及HCV复制的关系。
1 资 料 与 方 法
1.1一般资料 选择2010年11月—2014年10月河北省CHC患者257例，HCV感染超过6个月，血清抗-HCV阳性，HCV RNA ≥ 15 U/mL，丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和(或)天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)升高或肝脏病理学符合慢性肝炎表现，未经抗病毒、保肝等治疗，男性125例，女性132例，年龄16～78岁。排除合并慢性乙型肝炎等其他病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、酒精性肝病、药物性肝损伤、自身免疫性肝炎、原发性胆汁性胆管炎、原发性胆汁性肝硬化、遗传代谢性肝病、肝脏血管病等其他肝病患者，并排除失代偿期肝病、恶性肿瘤、胃肠道疾病、胆道疾病、严重心脑血管疾病、自身免疫性疾病、血液系统疾病、神经系统疾病等。所有患者均签署知情同意书。
1.2血清肝脏生化学检测 应用日本Olympus AU5400全自动生物化学分析仪检测血清ALT及AST水平。
1.3血清抗-HCV检测 应用酶联免疫吸附测定试剂盒[英科新创(厦门)科技有限公司产品]测定。
1.4HCV RNA检测 采用COBAS TaqMan系统[美国罗氏诊断产品(上海)有限公司产品]检测。
1.5IL-17 rs2275913及rs8193036位点SNPs检测 CHC患者外周血单个核细胞基因组DNA应用离心柱式DNA小量抽提试剂盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]提取，应用美国Thermo公司NanoDrop 2000C紫外分光光度计进行DNA定量分析。
采用TaqMan系统(美国Applied Biosystems公司产品)检测分析IL-17 rs2275913及rs8193036位点SNPs。应用美国Applied Biosystems公司ABI 7500实时定量PCR仪对提取的DNA样品(10 μL反应体系)进行扩增。IL-17 rs2275913及rs8193036位点TaqMan探针序列见表1。
PCR反应条件：95 ℃ 10 min，92 ℃ 15秒，60 ℃ 1 min，40个循环。
表1 IL-17 rs2275913及rs8193036位点TaqMan探针序列
Table1TaqMan probe sequences of IL-17rs2275913and rs8193036
1.6统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件处理数据。计量资料比较由于非正态分布采用秩和检验；计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1IL-17 SNPs分布 CHC患者中IL-17 rs2275913位点AA基因型携带者为69例(26.85%)，AG基因型为114例(44.36%)，GG基因型为74例(28.79%)。IL-17 rs8193036位点CC基因型携带者为105例(40.86%)，CT基因型为120例(46.69%)，TT基因型为32例(12.45%)。
2.2不同基因位点各基因型患者血清ALT和AST水平比较 IL-17 rs2275913位点中AA基因型携带患者血清ALT、AST水平较AG型和GG型高，差异有统计学意义(P<0.05)；而IL-17 rs8193036位点中CC、CT及TT基因型携带患者之间血清ALT及AST水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。
表2 IL-17 rs2275913及rs8193036位点各基因型患者血清ALT及AST水平比较
Table2Comparison of serum ALT and AST levels between patients with different genotypes of IL-17rs2275913and rs8193036 [M(Q1，Q3)]
*P<0.05与AG基因型比较 #P<0.05与GG基因型比较(秩和检验)
2.3不同HCV RNA水平患者IL-17 SNPs比较 IL-17 rs2275913位点A、G等位基因及rs8193036位点C、T等位基因分布在低HCV RNA水平(≤106U/mL，145例)与高HCV RNA水平(>106U/mL，112例)患者之间差异无统计学意义(P>0.05)；IL-17 rs2275913位点AA、AG、GG基因型及rs8193036位点CC、CT、TT基因型分布在低HCV RNA水平与高HCV RNA水平患者之间差异也无统计学意义(P>0.05)。见表3，4。
表3 不同HCV RNA水平患者IL-17 rs2275913位点等位基因及基因型分布比较
Table3Comparison of IL-17rs2275913polymorphisms between patients with different HCV RNA levels
表4 不同HCV RNA水平患者IL-17 rs8193036位点等位基因及基因型分布的比较
Table4Comparison of IL-17rs8193036polymorphisms between patients with different HCV RNA levels
3 讨 论
机体细胞免疫反应异常在HCV慢性感染及其导致的肝组织损伤的发生及进展中起重要作用[8-10]。Th17是新型T淋巴细胞亚群，具有促炎作用，可能导致肝炎病毒感染慢性化并参与肝脏免疫炎症，促进肝损伤发生并不断进展[11-12]。IL-17主要由Th17产生，可诱导多种炎症细胞因子及趋化因子表达，参与免疫调节及炎症反应。笔者前期研究显示CHC患者外周血IL-17生成单核细胞水平及血浆IL-17水平显著高于健康对照组[6,13]。随着病情进展，CHC患者肝脏Th17细胞呈持续增加趋势，且与HCV RNA水平、转氨酶水平及肝脏炎症程度相关[8]。另有研究显示，外周血Th17细胞频率及IL-17水平与肝炎后肝硬化的病情严重程度相关[9]。
IL-17基因位于人染色体6P12，近年来研究发现，IL-17基因SNPs与多种疾病的发生发展密切相关[14]。本研究分析了IL-17 rs2275913及rs8193036位点SNPs，并探讨其与肝组织损伤标志血清ALT及AST水平的关系，结果显示rs2275913位点AA基因型携带患者血清ALT、AST水平均显著高于AG及GG携带患者，提示AA基因型携带患者肝损伤程度可能更严重；而rs8193036位点各基因型携带患者之间血清ALT及AST水平差异无统计学意义。rs2275913位点位于IL-17基因启动子区域，A等位基因可增强启动子的活性，促进IL-17的表达，故AA基因型携带患者血清IL-17水平较高[15]。HCV感染后，IL-17可抑制感染HCV肝细胞的凋亡，使之存活，导致HCV感染的慢性化[16]。另外，IL-17还作为Th17诱导的炎症反应的启动因子，参与HCV感染所致肝脏炎症反应的发生及进展。IL-17受体位于肝脏内多种细胞(肝细胞、Kupffer细胞、肝星状细胞、窦内皮细胞等)，其主要效应细胞可能为Kupffer细胞。IL-17通过与Kupffer细胞等表达的IL-17受体结合，激活多条炎症细胞因子信号通路，包括核因子-κB通路、丝裂原活化蛋白激酶通路、c-Jun氨基端激酶通路、CCAAT/增强子结合蛋白通路、Janus激酶/磷酸肌醇3-激酶通路以及胞外信号调节激酶通路等，诱导其他炎症细胞因子如核因子-κB受体活化因子配体、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、IL-1、IL-6、IL-18、粒细胞集落刺激因子及粒-巨噬细胞集落刺激因子等，多种趋化因子如趋化因子配体及CXC趋化因子配体等、抗菌肽、黏蛋白及组织基质金属蛋白酶等表达，导致炎症细胞浸润及组织破坏。IL-17还可以与其他细胞因子协同作用，包括TNF-α、IL-1β及γ干扰素等，进一步加重炎症反应。另外，IL-17可直接作用于肝星状细胞表面的IL-17受体，活化HSC，并促进IL-6的产生及分泌，进而上调TNF-α及转化生长因子β等表达[17]。而IL-6与转化生长因子β协同作用又可以促进Th17分化，进一步促进IL-17等细胞因子产生并分泌，从而形成恶性循环，不断促进肝脏炎症及纤维化的发生及进展。因此，结合本研究结果，笔者推测携带IL-17 rs2275913位点AA基因型的HCV感染患者IL-17水平升高，通过与Kupffer细胞及肝星状细胞等细胞上的IL-17受体结合，激活多条炎症信号通路，增加炎症细胞因子、趋化因子等表达，趋化炎症细胞浸润，并引发炎症反应，导致肝组织损伤发生，并促进其进展。
HCV RNA复制水平受多种因素影响，有研究报道其与宿主基因多态性相关。本研究分析了IL-17 rs2275913及rs8193036位点各等位基因及基因型在低HCV RNA水平与高HCV RNA患者水平之间的分布差异，结果显示这2个位点SNPs与HCV RNA水平均无关，提示IL-17 rs2275913及rs8193036位点SNPs不影响HCV复制水平。
综上所述，IL-17 rs2275913位点SNPs可能与慢性HCV感染导致的肝损伤有关，AA基因型携带患者肝损伤可能更严重，而rs8193036位点SNPs与肝损伤无关。IL-17 rs2275913及rs8193036位点SNPs与患者HCV复制水平均无关。
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