自发性蛛网膜下腔出血是常见的出血性卒中疾病，其年发病率7～10/10万人，80%患者是因为颅内动脉瘤破裂出血所致[1-2]。动脉瘤性蛛网膜下腔出血具有较高的致死率及致残率，幸存者中多数具有认知功能障碍[3-5]。动脉瘤破裂导致的自发性蛛网膜下腔出血可引起颅内和颅外的多种并发症，除了神经系统本身的并发症(再出血、脑积水、癫痫、脑血管痉挛脑梗塞)外，还能引起其他系统的并发症(神经源性肺水肿、心电图的改变、心肌缺血、低钠血症及贫血等)，这些均会影响患者的预后。约22%动脉瘤性蛛网膜下腔出血患者存在肺部并发症，其中神经源性肺水肿(neurogenic pulmonary edema，NPE)的发生率为2.0%～42.9%[6-10]。动脉瘤性蛛网膜下腔出血患者如果并发NPE往往预后较差[11-14]，与其他卒中相比NPE更容易在蛛网膜下腔出血的患者中发生。但具体机制目前不详。近10年来，随着microRNA(miRNAs)的发现，基因图谱的研究已从DNA水平转移到RNA水平。miRNAs在转录后基因表达调控中具有重要意义。miRNA通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体(siRNA-induced silencing complex,RISC)降解mRNA或阻碍其翻译[15]。miRNA水平的失调已被证明与各种疾病如癌症、心血管疾病和神经系统疾病有关[15-16]。因为miRNA与Argonaute蛋白相结合，故其在外周血液中水平很稳定。不同类型的miRNA在多种血管性疾病中均有特异性的表达，如心肌梗死、动脉粥样硬化、高血压等[17-19]。对于颅内动脉瘤的相关研究，既往文献报道其与血浆中的miRNA有相关特异性的表达[20-23]。miRNA155可促进脑胶质瘤的生长，且miRNA155水平与其预后呈正相关[24]。本研究旨在探讨高分级动脉瘤性蛛网膜下腔出血患者血miRNA155水平能否预测NPE的发生。
1 资 料 与 方 法
1.1一般资料 本研究纳入2014年6月—2017年6月我院神经外科收治的高分级动脉瘤性蛛网膜下腔出血患者30例。其中蛛网膜下腔出血后发生NPE患者11例(位于前循环9例)，男性3例，女性8例，年龄43～67岁，平均(50±4)岁，并发高血压7例、糖尿病2例、高脂血症1例、冠心病2例、吸烟2例；未发生NPE的蛛网膜下腔出血患者19例(位于前循环16例)，男性9例，女性10例，年龄44～67岁，平均(52±7)岁，并发高血压8例、糖尿病2例、高脂血症1例、冠心病2例、吸烟5例。入选标准：①经头CT证实为自发性蛛网膜下腔出血，Hunt-Hess分级为Ⅲ～Ⅴ级；②经头数字减影血管造影证实为颅内动脉瘤破裂出血致蛛网膜下腔出血；③发病到入院时间<1 d；④入院后立即行床旁胸部X线片检查同时留取外周血标本行miRNA155检查。排除标准：有心肌梗死、心肌病或充血性心力衰竭病史的患者。同时选取同期体检者20例作为对照组，男性8例，女性12例，年龄42～60岁，平均(50±6)岁，并发高血压7例、糖尿病3例、高脂血症2例、冠心病3例、吸烟7例。3组性别、年龄、并发疾病差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。
本研究经医院伦理委员会通过，所有患者均签署知情同意书。
1.2方法 患者均每天检查是否发生NPE。NPE临床检查包括双肺听诊存在湿啰音，提示肺组织积液和存在泡沫样粉红色痰液；影像学检查包括明确的肺纹理模糊或伴有血管周围轮廓不清和肺门阴影[6]。所有胸部X线片均由影像放射学专家在不知道病史的情况下诊断。只有既符合临床又符合影像学表现的患者才能诊断为NPE。在发病后住院当天、住院第3天及住院第6天分别抽血检测miRNA155水平。所有患者需持续心电监护和持续血压监测，均留中心静脉置管，监测中心静脉压。静脉输注尼莫地平，开始剂量5 μg·kg-1·h-1，在接下来的5 h，如果没有不良反应，逐步增加到最大剂量25 μg·kg-1·h-1，3 d后改为口服用药，并维持21 d，如出现低血压，则减量或停用尼莫地平。静脉滴注20%甘露醇溶液0.7～0.35 g/kg，每6～8 h 1次，共用4 d。积极扩容、稀释血液、升高血压疗法用于治疗存在症状性脑血管痉挛的患者。对存在NPE的患者，避免血容量过多导致病情恶化。如需连续镇静，用咪达唑仑(0.1～0.2 mg·kg-1·h-1)联合瑞芬太尼(0.05～0.2 μkg-1·min-1)。根据病情需要采取气管插管和呼吸机辅助呼吸。
1.3外周血miRNA取材方法 常规抽取3组外周全血，抗凝离心后分离血浆，取500 μL血浆样本，加入1 500 μL TRIzol(Invitrogen公司，美国)，充分摇匀，室温放置15 min，加入氯仿，振荡混匀，再室温放置5 min，在4 ℃下离心15 min，吸取上层透明液体，加入其1.5倍体积的无水乙醇，按照miRNeasy试剂盒(Qiagen公司，美国)的操作手册用吸附柱吸附RNA，所获RNA 溶解于500 μL H2O(无核糖核酸酶)中。
1.4实时荧光定量PCR法检测miRNA155 在上述溶液中取60 ng RNA，置于miScript反转录试剂盒内(凯杰Qiagen公司，德国)将其反转录为cDNA，反转录反应条件为37 ℃ 1 h、95 ℃ 5 min。以cDNA为模板，再应用miScript SYBR Green PCR 试剂盒(凯杰Qiagen公司，德国)进行实时荧光定量PCR检测。以U6小核RNA(small nuclear RNA，snRNA)为内参照物，miRNA155和U6 snRNA的特异性引物根据其序列应用Primer Express 2.0软件(Applied Biosystem公司，美国)进行设计，U6的引物序列为5′-TTCGTGAAGCG-TTCCATATTT-3′，miRNA155的引物序列为5′-TCTGCTCATACTCTCCTGTC-3′，引物均由生工生物工程( 上海) 股份有限公司提供。然后在荧光定量PCR仪(BIO-RAD，美国)上进行实时荧光定量PCR检测。实时荧光定量PCR反应条件为95 ℃ 15 min，94 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 34 s，共40个循环。计算miRNA155的表达量，实验重复3次，制作标准曲线。
1.5统计学方法 应用SPSS 23.0统计学软件分析数据。计量资料比较采用重复测量的方差分析；计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1并发症比较 发生NPE与未发生NPE的高分级蛛网膜下腔出血患者发生脑积水、脑血管痉挛和再破裂出血发生率差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。
表1 发生NPE与未发生NPE组并发症比较
Table1Comparison of complications between NPEand without NPE(例数，%)
2.2血浆miRNA155水平比较 入院当天、住院第3天、住院第6天3组血浆miRNA155水平变化趋势不明显，发生NPE与未发生NPE的高分级蛛网膜下腔出血患者血浆miRNA155水平高于对照组，发生NPE的高分级蛛网膜下腔出血患者血浆miRNA155水平高于未发生NPE的高分级蛛网膜下腔出血患者，其组间、组间·时点间交互作用差异均有统计学意义(P<0.05)，时点间差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。
Table2Comparison of plasma miRNA155levels in3groups
3 讨 论
自发性蛛网膜下腔出血是常见的脑卒中疾病之一，病情急，进展快，80%是因为颅内动脉瘤破裂出血所致，其中高分级颅内动脉瘤破裂所致蛛网膜下腔出血患者占20%～30%，随着治疗技术不断的进步，尤其是介入治疗在近10年的快速发展及临床医生对疾病的深入认识，使蛛网膜下腔出血病死率明显降低，然而高分级蛛网膜下腔出血患者的病死率仍居高不下，其中90%死亡患者为高分级蛛网膜下腔出血[25]。
NPE很少发生在低分级蛛网膜下腔出血患者中，Saracen等[26]研究发现，伴有NPE的高分级蛛网膜下腔出血患者20例中死亡19例，而未伴发NPE的患者44例仅死亡20例。可见NPE是导致严重预后不良的因素之一。蛛网膜下腔出血患者的核心治疗策略是积极扩容、稀释血液、升高血压，以预防脑血管痉挛的发生，然而发生NPE患者多伴有心肺功能障碍，需更低的循环血容量避免心肺衰竭，血容量不足及血容量减少会导致迟发性脑缺血发作和不良预后[27]。因此，如果能提前预测NPE的发生，可以对患者进行个体化的治疗，从而避免发生NPE，降低高分级蛛网膜下腔出血患者的病死率。
miRNA具有明显的组织特异性，其在多种疾病中有不同的特异性表达谱[28]，不同类型的miRNA在脑动脉瘤等多种血管性疾病中都有特异性的表达[20-23]。研究发现miRNA155高表达可预测脑胶质瘤的不良预后[24]。miRNA155参与了多种肺部疾病的发生及恶化，尤其在肺部感染、肺部神经内分泌肿瘤及肺纤维化过程中特异表达增高[29-31]。miRNA155是否参与了NPE的发生鲜见相关文献报道。本研究通过miRNA实时荧光定量PCR检测显示，高分级动脉瘤性蛛网膜下腔出血患者血浆miRNA155水平明显高于对照组。表明miRNA155在发生NPE患者中明显增高，故可用于预测蛛网膜下腔出血后NPE的发生。
本研究所采标本为外周血，外周血的miRNA并不一定能准确反映颅内病变的miRNA变化，外周血中包含各类血细胞、代谢物质、内分泌物质，由于其成分的复杂性可能会导致检查指标的准确性及稳定性差。本研究结果显示，miRNA与NPE发生有关，但其特异性及准确性仍需进一步去验证。miRNA155是免疫应答的重要介质，如证实其参与了NPE的发生，则可能成为靶向治疗NPE特异靶向药物，故有很大的临床应用价值。
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