脑胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，起源于神经胶质细胞，呈浸润性生长。近年来，胶质瘤发病率呈上升趋势，目前的发病机制尚不明了，治疗主要是通过手术切除肿瘤，配合术后放、化疗为主的综合治疗，缓解患者症状，延长生存期。然而，高级别胶质瘤患者往往术后短期内复发，效果不理想，复发率、病死率高，是一种严重危害人类健康的疾病。神经元表达下调基因9(neural precursor cell expressed developmentally down-regulated，NEDD9)是一种细胞骨架蛋白分子，在多种常见恶性肿瘤组织中呈现高表达状态，并已证实其是一种与肿瘤发生、侵袭相关的分子，在肿瘤的发展过程中发挥重要的作用[1]。以往研究报道，NEDD9在胰腺癌、膀胱癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌、肺腺癌、食管癌[2-9]等多种肿瘤组织标本中过度表达，且与肿瘤的侵袭与转移相关，而关于NEDD9在脑胶质瘤中表达方面的研究鲜有报道。本研究旨在通过检测NEDD9在不同病理级别人脑胶质瘤中的表达，分析并探讨其临床意义。
1 资 料 与 方 法
1.1 一般资料 收集2015年9月—2016年10月河北省沧州市中心医院神经外科手术切除的人脑胶质瘤标本36例，男性19例，女性17例，年龄12～71岁，平均(49.6±2.5)岁；患者均是第一次接受手术治疗，且在手术之前未经过放射治疗/生物治疗或者化学治疗；所有取得的人脑胶质瘤组织标本均以世界卫生组织于2007年制定的神经系统肿瘤分类和分级为标准：低级别胶质瘤(Ⅰ～Ⅱ级)14例，高级别胶质瘤(Ⅲ～Ⅳ级)22例。同时收集因重型颅脑损伤患者行内减压而切除的脑组织标本10例作为对照组。所有获取的新鲜内减压脑组织标本、肿瘤组织标本均分为2份，其中一部分以4%多聚甲醛浸泡固定，分别经过脱水→透明→浸蜡→石蜡包埋4 μm层厚连续切片→烤片固定程序，最终制成石蜡切片保存备用，另外部分标本置于-80 ℃冰箱备用。
1.2 主要试剂和仪器 TRIzol试剂(美国Invitrogen公司)；浓缩型兔抗人多克隆抗体NEDD9(1∶200，Abcam，Cambridge，MA，USA)；RT-PCR试剂盒(美国TransGen公司)；SP免疫组织化学试剂盒(中杉金桥公司)。
1.3 免疫组织化学法检测肿瘤中NEDD9蛋白的表达 采用免疫组织化学染色方法，按照试剂盒指示的操作步骤进行，组织蜡块行4 μm层厚连续切片。石蜡切片常规脱蜡至水，微波修复抗原，NEDD9多克隆抗体稀释度为1∶300。二抗采用过氧化物酶标记，DAB显色。阴性对照以PBS为一抗。结果判定：采用双盲阅片法。选择每张切片免疫反应最强的区域，观察5个不重复视野，计算出NEDD9阳性细胞数量，阳性率=(阳性细胞数/总细胞数)×100%。无阳性细胞或阳性细胞数<5%为阴性(-)，5%～25%为弱阳性(+)，>25%～50%为阳性(++)，>50%为强阳性(+++)。
1.4 RT-PCR法检测NEDD9 mRNA转录水平 RNA按照试剂盒操作步骤采用Trizol法提取，经匀浆、分层、沉淀、洗涤、干燥提取后溶于DEPC水后置于-80 ℃冰箱保存备用。以逆转录得到的cDNA作为模板进行RT-PCR，参照文献设计NEDD9引物，β-actin作为内参照。NEDD9上游引物为5′-CATCAGGGTAAGGAGGARTTT-3′，下游引物为5′-TGGGTCTCACATTGGTCAT-3′，扩增产物长度124 bp。β-actin上游引物为5′-TCGTGGAAGGACTCATGACC-3′，下游引物为5′-AGGGATGATGTTCTGGAGAG-3′，扩增产物长度为97 bp。按照说明书操作，反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30次循环。取PCR产物5 μL，1.2%琼脂糖凝胶电泳，将电泳凝胶置于凝胶图像分析系统进行灰度分析。
1.5 统计学方法 应用SPSS 18.0统计软件包处理数据。计量资料比较分别采用单因素方差分析和SNK-q检验；计数资料比较采用χ2检验；等级资料比较采用秩和检验。 P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 3组NEDD9蛋白阳性表达率比较 NEDD9蛋白在细胞浆中出现背景清晰的黄色或棕黄色颗粒为阳性(图1)。NEDD9蛋白阳性表达率在正常脑组织，低级别胶质瘤、高级别胶质瘤中呈明显上升趋势，低级别胶质瘤组和高级别胶质瘤组NEDD9蛋白阳性表达率高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。
图1 NEDD9蛋白在人脑胶质瘤中的表达(SP ×400) A.对照组；B.低级别胶质瘤组；C.高级别胶质瘤组
Figure 1 Expression of NEDD9 in human glioma(SP ×400)
表1 3组NEDD9蛋白阳性表达率比较
Table 1 Comparison of the positive expression rate of 3 groups of NEDD9 protein (例数)
*P<0.05与对照组比较(χ2检验)
2.2 3组NEDD9 mRNA表达比较 NEDD9 mRNA在正常脑组织中表达量较少，在胶质瘤组织中表达明显升高。低级别胶质瘤组和高级别胶质瘤组NEDD9 mRNA表达量明显高于对照组，高级别胶质瘤组NEDD9 mRNA表达量明显高于低级别胶质瘤组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2，表2。
图2 NEDD9 mRNA在不同级别胶质瘤中的表达情况
M.对照组；1.低级别胶质瘤组；2.高级别胶质瘤组
Figure 2 The expression of NEDD9 mRNA in different grades of gliomas
表2 3组NEDD9 mRNA吸光度值比较
Table 2 Comparison of the absorbance value of 3 groups of NEDD9 mRNA 
*P<0.05与对照组比较 #P<0.05与低级别胶质瘤组比较(SNK-q检验)
3 讨 论
脑胶质瘤是颅内最常见的神经上皮组织源性肿瘤，起源于神经胶质细胞，是最常见的颅内原发性肿瘤，其发病率高，恶性程度高，治疗复杂，且预后差，是对人类健康造成巨大威胁的一类疾病[10]，5年病死率仅次于胰腺癌和肺癌，位列第三位[11]。在原发性中枢神经系统肿瘤中胶质瘤占40%，而其中又有50%为恶性胶质瘤[12]。近年来，原发性颅内肿瘤发病率呈上升趋势，目前胶质瘤的术前诊断主要依靠CT及MRI检查，术后病理获得最终诊断。现阶段治疗主要是手术切除肿瘤配合放、化疗的综合治疗，从而缓解临床症状、延长患者生存期；虽经上述治疗，高级别胶质瘤患者中位生存期仍不超过1年，多在治疗数月后复发，疗效难以令人满意，是目前神经外科的治疗难题，给患者带来极大痛苦，也给社会带来了一定负担。近年来，信号转导机制在胶质瘤研究中已经开始应用[13]，但关于NEDD9在人脑胶质瘤中的应用尚未见报道。
NEDD9是Cas家族重要成员之一，又称Cas-L，是骨架蛋白Cas家族蛋白成员，是一种新近发现的与肿瘤侵袭转移相关的因子，由843个氨基酸组成，具有多个SH2、SH3结构域，该结构域通过蛋白结合介导蛋白质之间的相互作用，定位于人类染色体的6p25～24，位于细胞浆，在介导细胞信号转导中发挥重要作用，能通过调节蛋白复合体调控细胞的黏附、迁移和侵袭、趋化作用、凋亡/失巢凋亡和细胞周期等诸多生物学行为。NEDD9在介导细胞信号传导中发挥信号转导的作用，它与许多细胞内信号分子之间有着广泛的联系，相互发挥重要的作用，在细胞的黏附、迁移、浸润、致癌性等方面起着非常重要的作用，在NEDD9表达增高情况下有丝分裂原激活的蛋白激酶、细胞外相关激酶及JNK被激活从而发挥作用[14]。本研究采用免疫组织化学法检测人脑胶质瘤中NEDD9蛋白表达情况，发现高级别胶质瘤、低级别胶质瘤组NEDD9蛋白阳性表达率明显高于对照组；此外，NEDD9 mRNA在低级别胶质瘤和高级别胶质瘤组的表达明显高于对照组，且随着胶质瘤的病理分级升高而增加。推测NEDD9在胶质瘤生长速度、侵袭、恶性程度等方面发挥着重要的作用，随着胶质瘤恶性程度的加重，其表达明显增强。这与王娜等[15]关于NEDD9在胃癌中的表达研究结果相一致，即NEDD9的表达在进展期胃癌中明显高于早期胃癌，同时与肿瘤的进展密切相关，随着浸润深度和分化程度的加重，其表达明显增强。此外，Zhou等[16]研究表明抑制NEDD9表达可抑制肝癌细胞增殖、迁移和侵袭，而上调表达NEDD9能促进了肝癌细胞在体外和体内的侵袭转移。本研究结果与其一致。
综上所述，NEDD9在胶质瘤生长、发展、侵袭等过程中起着重要的作用，并随着胶质瘤病理分级的升高表达上调。提示NEDD9在胶质瘤中高度表达，并且其表达量与胶质瘤的病理分级有关，期望其在胶质瘤术前诊断、判断预后以及将来作为治疗靶点的可行性等方面发挥重要的作用，从而抑制胶质瘤的发生、发展和复发，减轻患者症状，延长其生存期，改善其预后。但NEDD9参与胶质瘤生物学行为的具体分子机制尚不明确，仍有待于深入探讨。
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