·论 著·
贾晨光1，高建国1，姚晓伟1，王连波1，姚黎明1，李 雯2*
(1.河北省胸科医院骨科，河北 石家庄 050041；2.河北省胸科医院影像科，河北 石家庄 050041)
[摘要] 目的评估Xpert MTB/RIF技术在疑似脊柱结核早期诊断及耐药中的应用价值。方法应用Xpert MTB/RIF系统对168例疑似脊柱结核术中脓液标本进行检测，以临床诊断为金标准，计算Xpert MTB/RIF检测结核分枝杆菌的敏感度、特异度，并比较与抗酸染色、结核分枝杆菌快速培养敏感度、特异度的差异。结果168例脊柱结核患者术中脓液标本中，134例Xpert MTB/RIF检测结核分枝杆菌阳性，其中利福平耐药25例。以临床诊断为金标准， Xpert MTB/RIF检测结核分枝杆菌的敏感度为79.76%(134/168)，特异度为96.87%(47/50)。 在134例脊柱结核脓液标本中存在利福平耐药突变基因25例，耐药突变率为18.66%。168例脊柱结核患者脓液标本中，抗酸染色阳性51例，结核分枝杆菌快速培养阳性70例。结论Xpert MTB/RIF是一种能够同时对脊柱结核行结核分枝杆菌与利福平耐药性检测的分子检测技术，在脊柱结核的快速诊断中具有较高的诊断价值。
[关键词]结核，脊柱；诊断；耐药 doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2018.09.009
脊柱结核为常见的肺外结核，占肺外结核患者的11.3%～34.5%，部分病例临床表现不典型，病变位置较深，标本不易获得，病灶含菌量少，给脊柱结核的早期诊断提出严峻的挑战，大部分患者确诊时有明显骨质破坏，遗留有残疾。目前诊断技术尚不能满足脊柱结核早期诊断的需要[1]。近年来，Xpert MTB/RIF检测技术被用于在肺结核痰液标本及部分肺外结核标本中检测结核分枝杆菌及利福平耐药性，其具有敏感度和特异度高、生物安全性好、耗时短等优点，2010年WHO推荐其用于肺结核痰标本的检测。 然而，Xpert MTB/RIF技术在脊柱结核临床标本检测中的可行性及准确性目前尚无相关报道[2]。本研究应用Xpert MTB/RIF技术对168例疑似脊柱结核术中病灶脓液标本进行检测，旨在评价该技术在脊柱结核早期诊断及利福平耐药检测中的应用价值[3]。
1.1标本收集 回顾性分析2015年6月—2016年12月于河北省胸科医院骨科行手术治疗的168例疑似脊柱结核患者的临床资料。其中颈椎9例，上胸椎15例，下胸椎34例，胸腰段33例，腰椎77例； 男 98例，女70例；年龄34～77岁，平均(52.2±12.2)岁。术中取病灶组织、脓液送病理科，分别行抗酸涂片、 BACTEC MGIT 960分枝杆菌液体培养系统快速培养，培养阳性者行改良罗氏绝对浓度法药敏试验、Xpert MTB/RIF 检测。
1.2Xpert MTB/RIF检测 该技术由美国Cepheid公司研发，以半巢式荧光定量PCR技术为基础，是可同时进行结核分枝杆菌及利福平耐药性检测的自动化、全封闭检验平台。Xpert MTB/RIF操作步骤： 首先将冰冻沉淀物解冻，再根据Xpert MTB/RIF操作规程，取1 mL脓液并加入1.5 mL标本处理液，轻微混匀后室温孵育15 min；然后再次轻微混匀10 s后室温孵育5 min，取2 mL标本加入至一次性标本盒，将标本盒置入4通道GeneXpert平台中自动运行。加入标本盒后约2 h，系统可自动读出结核分枝杆菌检测结果与利福平耐药结果。
1.3菌种鉴定及药敏试验 将术中所取病灶脓液标本送结核菌室行药敏检测，采用BACTEC MGIT 960结核分枝杆菌培养系统进行菌种鉴定，将培养阳性的样本进一步采用改良罗氏绝对浓度法进行12种抗结核药物药敏试验。具体操作步骤参照《结核病诊断细菌学检验规程》[4]，具体药物浓度检测的上、下限分别为：异烟肼(1～10 μg/mL)、利福平(50～250 μg/mL)、链霉素(10～100 μg/mL)、乙胺丁醇(5～50 μg/mL)、左氧氟沙星(2～20 μg/mL)、对氨基水杨酸异烟肼(0.1～1 μg/mL)、丙硫异烟胺(25～100 μg/mL)、阿米卡星(10～100 μg/mL)、卷曲霉素(10～100 μg/mL)、莫西沙星(0.5～2 μg/mL)、利福布丁(0.75～3 μg/mL)、环丙沙星(1～10 μg/mL)、利福喷丁(0.75～3 μg/mL)、克拉霉素(15～25 μg/mL)。
1.4涂片抗酸杆菌检查 将术中脓液标本处理之前，保存在2～8 ℃条件下，3 d内完成标本处理，依照《涂片镜检标准化操作及质量保证手册》的要求，进行抗酸染色镜检。
1.5临床诊断标准 依据英国国家卫生医疗质量标准署2011年制定的《脊柱关节结核临床诊断标准》：①病变脓液结核分枝菌杆培养阳性；②病理结果回报示干酪样坏死、肉芽肿性病变伴坏死；③影像学包括X线摄片、CT、MRI等检查符合典型结核表现；④抗结核药物治疗有效。符合上述任何一项即临床诊断为脊柱结核，不符合者诊断为非结核性脊柱感染[5]。
1.6统计学方法 应用SPSS 15.0统计软件分析数据，计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1结核杆菌培养及药敏结果 168例脊柱结核患者，经BACTEC MGIT 960分枝杆菌液体培养系统培养阳性70例、阴性98例(抗酸染色阳性11例、阴性87例)，药敏试验显示对利福平耐药27例，对利福平敏感43例；抗酸染色阳性51例、阴性117例。
2.2Xpert MTB/RIF检测结核分枝杆菌结果 应用Xpert MTB/RIF系统对168例脊柱结核术中脓液标本进行结核分枝杆菌检测，其中含有结核分枝杆菌134例，阳性检出率为79.76%。在70例培养阳性标本中，Xpert MTB/RIF检出含有结核分枝杆菌69例。以结核菌培养为金标准，Xpert MTB/RIF检测结核分枝杆菌的敏感度为98.57%(69/70),特异度为91.84%(90/98)。
2.33种检测方法的敏感度、特异度 抗酸染色、结核菌培养、Xpert MTB/RIF检测的敏感度分别为30.35%、41.67%、79.76%，特异度分别为100.00%、100.00%、96.87%%。Xpert MTB/RIF检测较抗酸染色、结核菌培养敏感度高，差异有统计学意义(χ2=36.710,P<0.05),而3种检测方法特异度差异无统计学意义(χ2=0.530,P>0.05)。
2.4Xpert MTB/RIF检测rpoB基因突变 在27例利福平耐药脊柱结核临床标本中，Xpert MTB/RIF系统检出25例发生rpoB基因突变。 耐药基因突变，以表型药敏试验为金标准，采用Xpert MTB/RIF行利福平耐药性检测的敏感度为92.59%(25/27)，特异度为97.67%(42/43)。
目前脊柱结核的诊断方法很多，传统的检测方法包括脓液抗酸涂片、罗氏培养基培养、病变组织病理检查等，检出阳性率较低，耗时长。抗酸涂片检查阳性时，脓液标本的结核分枝杆菌浓度>1 000个/mL。罗氏培养基培养要求标本中至少含有10～100个活菌才能得到阳性结果,且需要6～8周时间。由于缺乏有效的快速诊断方法，致使脊柱结核患者诊断延误，不能得到及时治疗，病变进展。脊柱结核病灶处结核菌含量少，使抗酸染色、罗氏培养、结核杆菌快速培养的敏感性降低。由于脊柱结核病灶位置深，穿刺标本体积有限，穿刺位置可能不是典型病变，病变组织的病理检查常提示慢性炎症、肉芽组织，与其他椎间隙感染性病变不易鉴别，易造成漏诊或延误诊断[6-8]。
Xpert MTB/RIF是一种基于real-time PCR的技术，能同时检测结核分枝杆菌及利福平耐药基因突变。Xpert MTB/RIF 检测是以半巢式荧光定量PCR为基础，通过自动化全封闭检测平台，自动完成标本纯化、核酸扩增、提取纯化及浓缩等试验步骤。这一过程在密闭的标本盒中进行。Xpert MTB/RIF技术针对rpoB基因81 bp利福平耐药核心区间设计引物、探针，检测其是否发生突变，进而用于辅助诊断是否为结核以及是否对利福平耐药(rpoB序列存在突变)。检测获得结果的时间仅为2 h。
本研究通过采用统一的病灶脓液标本，以临床诊断为金标准，评价Xpert MTB/RIF对于脊柱结核患者脓液标本的诊断效能，结果显示Xpert MTB/RIF在脊柱结核脓液标本检测中的敏感度为79.76%，特异度为96.87%，同时提供利福平耐药基因突变信息，利福平的耐药基因突变率为18.66%。
本研究中有34例脊柱结核患者Xpert MTB/RIF检测为阴性，出现阴性的原因分析为：抗结核治疗后脊柱结核病灶脓液标本中结核菌含量减少，脓液标本中结核分枝杆菌复合群DNA基因中ropB降解[9-11]。
本研究结果显示，Xpert MTB/RIF的敏感度为79.76%，明显高于抗酸染色的30.35%及结核菌培养的41.67%(P<0.05)，且其特异度大于95.00%。故Xpert MTB/RIF在脊柱结核的早期诊断上有较高的诊断价值。
Xpert MTB/RIF技术不仅能检测结核分枝杆菌,而且能同时检测利福平耐药性。随着耐多药结核发病率的增高,早期获得结核分枝杆菌的药敏试验结果有助于制定适宜的化疗方案,缩短疗程[12-13]。本研究中发现3例利福平耐药基因 ropB突变患者，其药物敏感性试验结果显示为异烟肼、利福平、链霉素、左氧氟沙星耐药。
本研究Xpert MTB/RIF技术检测耐利福平结核病的敏感度达到了92.59%，与传统药敏试验的一致率达到95.71%。利福平耐药可作为耐多药结核的指征，对利福平或其他第一线药物耐受，需及时行药敏试验，并更换二线药物[3，14]。
Xpert MTB/RIF检测流程只需2.5 h完成，可以做到在患者就诊的同时，帮助医生作出对结核患者或是耐药结核患者的诊疗决定。 本研究应用Xpert MTB/RIF检测脊柱结核术中脓液标本，获得了很高的敏感度、特异度，以及与金标准传统药敏试验很高的一致性[15-16]。
综上所述，Xpert MTB/RIF技术具有操作简单、耗时短、敏感度及特异度高、生物安全性好、早期诊断结核分枝杆菌耐药等优点，在脊柱结核的快速诊断中具有较高的诊断价值。但本研究存在样本量及单中心的局限性，未来尚需要进行多中心、大样本的对照性试验研究。
[参考文献]
[1] 张志学,苍爱泽,孙静,等.应用Xpert MTB/RIF技术检测肺泡灌洗液对菌阴肺结核的临床诊断价值[J].结核病与肺部健康,2017,6(2):128-130.
[2] 伊惠霞,侯新月,王泉,等.Xpert MTB/RIF系统快速检测结核分枝杆菌及利福平耐药性研究[J].新疆医科大学学报,2014，37(12):1643-1646.
[3] 陈禹,李桂琴,刘旭辉,等.Gene Xpert MTB/RIF在HIV阴性泌尿系结核中的诊断价值[J].中国防痨杂志,2017,39(10):1100-1106.
[4] 蔡闯,钟南山.结核分枝杆菌及多重耐药性的快速检测：MTB/RIF实验及检测诊断系统[J].解放军医学杂志,2012,37(10):998-1002.
[5] 李辉，谭耀驹，李洪敏，等.利福平耐药实时荧光定量核酸扩增检测技术的诊断效果对比研究[J].中国防痨杂志，2014,36(6):998-1002.
[6] 贾文韫，李元.Xpert MTB/RIF在骨关节结核患者快速诊断中的应用[J].中国脊柱脊髓杂志,2015,25(3):208-212.
[7] 李力韬，李洪敏，马远征,等.应用Xpert MTB/RIF对脊柱结核临床标本行结核分枝杆菌与利福平耐药性检测的验证性研究[J].中华骨科杂志，2014,34(2):211-215.
[8] 李桢，马远征，秦世炳，等.Gene Xpert MTB/RIF技术的应用进展及其在骨关节结核诊断中的价值[J].中国防痨杂志，2016,38(4):322-326.
[9] 陈敏, 陈捷, 宋大伟,等.三种检测技术联用在结核性胸膜炎诊断中的应用价值[J].中国防痨杂志，2016，38(8):462-466.
[10] 赵冰，欧喜超, 夏辉,等.Xpert MTB/RIF检测技术在结核病诊断中的应用评价[J].中国防痨杂志,2014,36(6):462-466.
[11] 许礼峰，祝进，朱晟海，等. Xpert MTB/RIF检测结核分枝杆菌和利福平耐药的应用研究[J].中华临床感染病杂志,2016，9(1):66-68.
[12] 李卓, 张贺龙, 姚黎明，等.个体化术式联合闭合置管灌洗治疗复治脊柱结核的临床研究[J].河北医科大学学报，2017,38(7):770-773.
[13] 梁瑞霞，谷蕴婷，董伟杰，等.两种分子检测技术快速诊断骨关节结核及其耐药性的研究[J].中国防痨杂志，2015,37(11):1126-1129.
[14] 江万航，卫安娜，庞慧敏，等.实时荧光核酸恒温扩增检测技术在疑似肺结核早期诊断中的临床意义[J].中国防痨杂志，2017,39(12):1309-1312.
[15] 姚晓伟,董昭良,贾晨光,等.一期前路病灶清除植骨内固定治疗胸椎结核伴神经损伤效果分析[J].河北医科大学学报,2016,37(9):1018-1022.
[16] 刘丰胜，姚黎明，贾晨光，等.病灶持续冲洗在脊柱结核合并椎旁脓肿手术治疗中的应用[J].河北医科大学学报,2016,37(9):1018-1022.
JIA Chen-guang1, GAO Jian-guo1, YAO Xiao-wei1,WANG Lian-bo1, YAO Li-ming1， LI Wen2*
(1.Department of Orthopedics，Hebei Chest Hospital，Shijiazhuang050041,China； 2.Department of Medical Imaging,Hebei Chest Hospital，Shijiazhuang050041,China)
[Abstract]ObjectiveTo assess the value of Xpert MTB/RIF in the early diagnosis and drug resistance of suspected spinal tuberculosis.MethodsAppling the Xpert MTB/RIF system to detect pus specimens from 168 suspected spinal tuberculosis surgery. Taking clinical diagnosis as the gold standard，the sensitivity and specificity of Xpert MTB/RIF for detection of Mycobacterium tuberculosis were calculated, and the differences in sensitivity and specificity between acid-fast staining and rapid culture of Mycobacterium tuberculosis were compared.ResultsIn the pus specimens of 168 patients with spinal tuberculosis, 134 cases of Xpert MTB/RIF were positive for Mycobacterium tuberculosis, of which 25 cases were resistant to rifampicin.Clinical diagnosis as the gold standard，the sensitivity of Xpert MTB/RIF for detecting Mycobacterium tuberculosis was 79.76%(134/168) and the specificity was 96.87%(47/50).There were 25 rifampicin-resistant mutant genes in 134 cases of spinal tuberculous pus, and the drug-resistant mutation rate was 18.66%. In the pus specimens of 168 patients with spinal tuberculosis, 51 cases were positive for acid-fast staining and 70 cases were positive for rapid culture of Mycobacterium tuberculosis.ConclusionXpert MTB/RIF is a molecular detection technique that can simultaneously detect mycobacterium tuberculosis and rifampicin resistance in spinal tuberculosis.It has high diagnostic value in the rapid diagnosis of spinal tuberculosis.
[Key words]tuberculosis， spinal； diagnosis； resistance
[收稿日期]2018-04-11；
[中图分类号]R529.2
[文献标志码]A
[文章编号]1007-3205(2018)09-1031-04
[修回日期]2018-05-02
[基金项目]河北省科技计划项目(18277764D)
[作者简介]贾晨光(1975-)，女，河北唐县人，河北省胸科医院主任医师，医学硕士，从事骨结核疾病诊治研究。
*通讯作者。E-mail：493301009@qq.com
(本文编辑：赵丽洁)