表1 不同子宫组织相关指标阳性表达比较
Table1Comparison analysis of positive expression results in different groups(n=43，例数，%)
·论 著·
张冬红，刘恩令
(河北省唐山市工人医院妇产科，河北 唐山 063000)
[摘要] 目的分析血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、微小RNA-18a(microRNA-18a，miR-18a)、微小染色体维持蛋白7(minichromosome maintenance 7，MCM7)在子宫肌瘤组织中的表达及其临床意义。方法通过免疫组织化学法测定43例子宫肌瘤组织和瘤旁组织中的VEGF、MCM7、孕激素受体(progesterone receptor，PR)及雌激素受体(estrogen receptor，ER)的表达，通过原位杂交法测定miR-18a的表达，并对表达结果进行比较分析。结果VEGF、MCM7、PR、ER在子宫肌瘤组织中的阳性率明显高于正常子宫肌组织，而miR-18a阳性率明显低于正常子宫肌组织(P<0.05)；Spearman相关分析结果显示，PR、ER与VEGF、MCM7均呈明显正相关(P<0.05)，与miR-18a呈明显负相关(P<0.05)。结论在子宫肌瘤组织中VEGF、MCM7均呈高表达，miR-18a呈低表达，与子宫肌瘤发生发展密切相关。
[关键词]平滑肌瘤；血管内皮生长因子；孕激素类；雌激素类 doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2018.09.010
子宫肌瘤为女性生殖系统中常见的一种良性肿瘤[1]，具有较高的发病率，在育龄女性中子宫肌瘤的发病率达40%左右，可导致患者出现盆腔压迫症状以及子宫异常出血等，并对患者生育能力造成一定影响，且部分患者如不及时给予治疗可能会发生恶性病变[2]。由于多数患者无症状出现，真实发病率要明显高于临床报道的发病率。目前对于子宫肌瘤的发病机制尚未明确，但普遍认为是与细胞增殖、细胞信号传导途径异常等因素相关[3]。近年来，子宫肌瘤的发病趋于年轻化，故子宫肌瘤的发生发展成为众多学者所关注的重点，尤其针对于多因子在其发生发展以及血管再生中的作用。微小染色体维持蛋白(minichromosome maintenance，MCM)已被证实为机体中一种DNA复制管制复合物，MCM7为MCM家族重要成员，在多种疾病中呈高表达[4]。微小RNA(microRNA，miR)为广泛存在于真核生物细胞当中非编码单链性的小分子RNA，在激素依赖性疾病、肿瘤以及自身免疫性疾病发生发展中起到了重要作用[5]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是促血管生成因子的一种，在子宫肌瘤患者中其血清水平明显升高[6]。本研究分析VEGF、miR-18a和MCM7在子宫肌瘤组织中的表达及临床意义，旨在为临床防治子宫肌瘤提供新的线索和依据。
1.1一般资料 收集2015年1月—2017年6月我院收治的43例行子宫肌瘤切除术患者的手术切除标本作为子宫肌瘤组织，距离子宫肌瘤至少1 cm处子宫肌组织作为正常子宫肌组织。入选标准：①均行子宫肌瘤切除术；②均经病理学诊断为子宫肌瘤；③年龄>50岁；④绝经至少1年。排除标准：①入组前3个月应用过激素类药物者；②伴有恶性肿瘤者；③合并甲状腺疾病、糖尿病者；④合并子宫其他器质性病变者；⑤合并免疫系统疾病、感染性疾病者。年龄52～78岁，平均(67.3±5.3)岁；肌瘤直径3～14 cm，平均(7.9±2.1)cm；肌瘤数目1～5个，平均(1.8±0.4)个；肌瘤分型：浆膜下肌瘤11例，肌壁间肌瘤23例，混合型9例。
1.2方法
1.2.1主要试剂 VEGF、MCM7抗体均购自英国Abcam公司；Has-miR-18a miRCURY LNADetection probe以及地高辛标记LNA miR-18a均购自丹麦Exiqon 公司；抗原修复液、二氨基联苯胺酶底物显色试剂盒、SP免疫组化染色试剂盒、Tris-HCl缓冲盐溶液、二氨基联苯胺、磷酸盐缓冲液均购自大连宝生物公司。
1.2.2标本采集及处理 以子宫肌瘤中心和肌瘤边缘连线的中间处选取直径2～10 cm的子宫肌瘤组织，距离子宫肌瘤至少1 cm处取子宫肌组织，大小约为1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm；标本采集完成之后，立即放置于10%中性福尔马林溶液中内固定12～24 h，采取石蜡包埋法并连续切片，切片厚度为3～4 μm。
1.2.3miR-18a表达测定 通过原位杂交法法测定miR-18a表达，将石蜡包埋组织石蜡并水化，取柠檬酸盐抗原进行修复，温度为49.5 ℃，取杂交缓冲液进行预杂交，时间为2 h，然后加入地高辛labeledmi RCURY probes过夜；加入辣根过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，浓度为1∶200，孵育过夜，温度为4 ℃；取Tris-HCl缓冲盐溶液进行冲洗，在暗室中加入染色溶液，然后孵育24 h；达到预期亮度后将载玻片转移至终止液终止反应，进行苏木素复染。
1.2.4VEGF、MCM7、孕激素受体(progesterone receptor,PR)、雌激素受体(estrogen receptor,ER)表达测定 取二甲苯将石蜡包埋切片蜡至去离子化，取乙二胺四乙酸修复缓冲液进行修复，然后打孔剂洗涤，采用3%过氧化氢进行室温孵育，时间为10 min，取磷酸盐缓冲液洗涤，再分别滴加一抗，孵育过夜，温度为4 ℃；再次取磷酸盐缓冲液进行洗涤，滴加二抗，孵育30 min，温度为37 ℃；磷酸盐缓冲液洗涤后采用二氨基联苯胺进行显色，然后冲洗，取苏木素进行复染，采用洗洁精、梯度乙醇以及中性树胶分别进行洗片、脱水以及封片。
1.2.5表达结果评价 按照阳性细胞的比例进行结果判定，不染色或者阳性细胞比例在5%以下为阴性(-)；阳性细胞比例在10%～25%之间为弱阳性(+)；阳性细胞比例在26%～50%之间为中等阳性(++)；阳性细胞比例在51%以上，且染色分布呈弥散表现为强阳性(+++)。
1.3统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件处理数据。计数资料比较采用χ2检验；相关性采用Spearman相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1不同子宫组织各指标阳性表达比较 子宫肌瘤组织VEGF、MCM7、PR、ER阳性率均明显高于正常子宫肌组织(P<0.05)，而miR-18a阳性率明显低于正常子宫肌组织(P<0.05)，见表1。
表1 不同子宫组织相关指标阳性表达比较
Table1Comparison analysis of positive expression results in different groups(n=43，例数，%)
2.2相关性分析 PR与VEGF、MCM7均呈明显正相关(rs=0.682、0.354,P<0.05)，与miR-18a呈明显负相关(rs=-0.492，P<0.05)；ER与VEGF、MCM7均呈明显正相关(rs=0.564、0.314,P<0.05)，与miR-18a呈明显负相关(rs=-0.471，P<0.05)。
子宫肌瘤是女性生殖器系统最为常见的一种疾病，发病初期普遍无显著临床特征，随着病情的发展患者会出现月经失调、经量过多、排尿困难等症状[7],巨大子宫肌瘤少见[8]，有时难以与腺肌瘤鉴别诊断，点定量弹性成像技术有助于子宫肌瘤与腺肌瘤的鉴别[9]。子宫肌瘤发生发展是多因素共同作用的结果，病因尚未完全明确，目前临床相关研究报道显示，该病属于甾体激素依赖性疾病，子宫肌瘤的生长与雌激素、孕激素有关[10-12]，孕激素和雌激素分别通过PR、ER发挥作用[13]。孕激素可以促进子宫肌瘤生长，而且由于PR、ER与孕激素和雌激素亲和力较高，能够选择性保留高浓度的孕激素和雌激素，进而增强了生物学作用。本研究结果显示子宫肌瘤组织PR、ER阳性率明显升高。与相关临床研究结果一致[14]。表明在子宫肌瘤的发展中PR、ER发挥了重要作用；另外，亦与细胞因子、基因、遗传、细胞信号传导途径异常及细胞增殖和凋亡等多种因素相关[15-16]。
VEGF属于一种糖基化多肽性分泌因子，以二硫键交联结合2个相同亚基。VEGF能够促进内皮细胞的有丝分裂，增加机体血管的通透性，促进血管的生成，在多种肿瘤的新生血管形成、血管重塑等过程中发挥了重要作用[17]。肿瘤生成的必要条件是血管生成，血管生成是肿瘤发展的限速阶段。若血液供应停止，实体肿瘤的直径最大只有2 mm。本研究结果显示，在子宫肌瘤组织中VEGF阳性率明显高于瘤旁组织。这与王艳等[18]的研究结果一致。本研究还显示，PR、ER的高表达与VEGF密切相关。表明VEGF受体通过介导雌、孕激素调节多种与细胞增殖相关的基因表达，在参与子宫肌瘤新血管生成以及内皮增生局部因子中，VEGF的表达较强，而VEGF的表达提高了血管的通透性，从而为多种细胞迁移提供了有利的纤维网络，促进了肌瘤的发展[19]。
miRNA是非编码小分子RNA，由20～25个核苷酸组成，被包裹在凋亡小体、微小体或者外泌体之中，它们与血浆中小分子物质在化学修饰作用下形成囊泡及蛋白复合体，而膜性结构可避免miRNA在机体内被降解，形成的复合物进入机体后被转运至受体细胞，然后通过内吞、膜融合、受体结合等方式调节细胞的增殖、分化和凋亡等生物学效应[20]，其在细胞内外环境中的高度稳定性及组织来源的特异性是其显著的特点。近年来，随着临床中基因组学研究逐步深入，人们对于miRNA与肌瘤的关系有了全新的认识，越来越多的学者发现，子宫肌瘤与miRNA有着密切关系，多种miRNA如miR-21、miR-197、miR-29b以及let-7等在子宫肌瘤组织中出现明显的异常表达现象，其通过作用于不同的靶基因，进而在子宫肌瘤发生发展中发挥重要作用[21-22]。ER包括ERα和ERβ 2种亚型。有研究显示，miR-18α表达降低，而ERα表达升高，二者呈负相关，并指出miR-18α的靶基因可能为ERα[23]。本研究结果显示，子宫肌瘤组织中miR-18a阳性率明显降低，且与PR、ER表达均呈明显负相关。表明其表达失调可能促进了子宫肌瘤细胞增殖，进而促进了子宫肌瘤进展。
肿瘤与细胞周期之间有着密切关系，细胞周期和DNA复制调控有关。MCM是一组与细胞增殖和DNA复制有关的蛋白家族，其具有普遍存在性和高度保守性。在细胞外，MCM4、6、7形成的双三聚体具有解螺旋酶活性，而在细胞内，只有MCM2～7形成的六聚体才具有解螺旋酶活性，在基因组、染色体重构及DNA复制中起到了重要作用。在细胞当中MCM蛋白表达量呈现周期性的表现，当处于G1/S转换时MCM蛋白表达量达到峰值，而当细胞进入至G0期或者分化期时，MCM蛋白表达量明显降低，甚至不表达。因此，MCM蛋白可以作为细胞增生状态评估的一个重要特异性标志[24]。MCM7是MCM家族重要成员，在确保DNA复制起始过程稳定中发挥重要作用，能够保证在一个周期之中DNA复制仅有1次，因而MCM7表达水平提高说明细胞增生、增殖明显进展[25]。本研究结果显示，子宫肌瘤组织MCM7阳性率明显升高，而且与PR、ER高表达相关。
综上所述，在子宫肌瘤组织中VEGF、MCM7均呈高表达，miR-18a呈低表达，与子宫肌瘤发生发展密切相关。不过本研究的样本量偏少，应扩大样本量进一步证实。
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ZHANG Dong-hong， LIU En-ling
(Department of Gynecology，Tangshan Gongren Hospital,Heibei Province，Tangshan063000，China)
[Abstract]ObjectiveTo analyze the expression and clinical significance of vascular endothelial growth factor(VEGF), microRNA-18a(miR-18a) and minichromosome maintenance 7(MCM7) in uterus myoma tissues.MethodsThe expression of VEGF, progesterone receptor (PR), estrogen receptor (ER) and MCM7 of 43 uterus myoma tissues and peri-myoma normal tissues were detected by immunohistochemistry,the expression of miR-18a were detected by in situ hybridization method.The expression results were compared and analyzed.ResultsThe positive rates of VEGF, PR, ER and MCM7 in uterus myoma tissues were significantly higher than those in peri-myoma normal tissues,the positive rates of miR-18a was significantly lower than those in peri-myoma normal tissues(P<0.05). The results of Spearman correlation analysis showed,the expression of PR,ER were positively correlated with the expression of VEGF, and MCM7(P<0.05) were positively correlated with the expression of miR-18a(P<0.05).ConclusionThere are high expression of VEGF, MCM7 in uterus myoma,the expression of miR-18a is low,It is closely related with the occurrence and development of myoma of uterus.
[Key words]leiomyoma； vascular endothelial growth aactor； progestins； estrogens
[收稿日期]2018-01-05；
[中图分类号]R738.7
[文献标志码]A
[文章编号]1007-3205(2018)09-1034-04
[修回日期]2018-01-25
[作者简介]张冬红(1979-)，女，河北唐山人，河北省唐山市工人医院主治医师，医学硕士，从事妇科疾病诊治研究。
(本文编辑：刘斯静)