· 论 著 ·
刘丽娅，马景学 * ，安建斌，马月磊
(河北医科大学第二医院眼科，河北 石家庄 050000)
[ 摘要 ] 目的 采用2种方法进行兔眼内增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)模型的建立，对比2种方法的成模时间和效果。 方法 两实验组分别给予玻璃体腔注射视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞与白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)的混合液或单纯RPE细胞进行造模，对照组给予玻璃体腔注射生理盐水，术后进行玻璃体、眼底、B超等检查，对玻璃体混浊程度和PVR程度进行分级，并计算视网膜脱离发生率。 结果 术后7 d 2组PVR发生率均为100%，但注射RPE细胞联合IL-1β组较单纯注射RPE细胞组PVR发生更早、程度更重、视网膜脱离发生率更高。 结论 通过玻璃体腔注射RPE细胞联合IL-1β建立兔眼PVR模型的方法较单纯注射RPE细胞效果更佳，更符合PVR的病理过程。
[ 关键词 ] 玻璃体视网膜病,增生性；视网膜色素上皮；视网膜脱离
增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy,PVR)多发生于裂孔源性视网膜脱离后，是导致手术失败的常见原因。PVR的病理过程分为炎症期、增殖期及瘢痕期，炎症期是PVR的最初阶段，白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)是早期重要的炎症因子。视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)细胞是参与PVR发病过程的最主要细胞。笔者前期研究通过体外培养RPE细胞，观察到姜黄素、丹参单体及苦参碱对RPE细胞均具有明显抗增殖作用，同时证实了姜黄素在抗增殖和抗炎方面发挥的重要作用及相关机制 [1-3] 。建立动物模型是PVR体内实验研究的基础，一种合适的动物模型应更加接近PVR的病理过程，且成模更快。玻璃体腔注射RPE细胞作为传统的PVR造模方法沿用已久，本研究采用玻璃体腔注射RPE细胞联合IL-1β的方法进行兔眼内PVR模型的建立，更加接近PVR早期炎症阶段，与传统的细胞模型进行对比，旨在寻求更佳造模方法。
1 . 1 材料
1 . 1 . 1 实验动物 新西兰白兔36只(河北省实验动物中心提供)，雌雄不限，平均体重3 kg。实验过程和动物饲养符合ARVO的相关规定。
1 . 1 . 2 实验细胞 原代兔RPE细胞的分离和培养参照笔者以往的报道 [1] ，取对数生长期的第3～4代兔RPE细胞用于实验。
1 . 1 . 3 主要试剂与仪器 重组人IL-1β(美国eBioscience公司)；裂隙灯显微镜SL-1E型(日本Topcon公司)；间接眼底镜Ra-200型(北京安视佳科技公司)；眼底照相系统FDDnet216型(福州福达公司)；A/B超声诊断仪(法国光太公司)。
1 . 2 方法 RPE细胞经胰酶消化后以生理盐水配制成10 6 /0.1 mL备用。兔眼充分散瞳后于颞上象限角膜缘后1.5～2 mm处进行玻璃体腔注射，实验组1(12眼)注入RPE细胞(1×10 6 个)和IL-1β(250 U)混合物共0.1 mL，实验组2(12眼)注入RPE细胞0.1 mL(1×10 6 个)，对照组(12眼)注入生理盐水0.1 mL。术后1，7，14，28 d通过间接眼底镜、眼底彩色照相和B超观察玻璃体混浊程度、PVR发生及视网膜脱离情况。玻璃体混浊程度分级：0级，玻璃体无混浊；Ⅰ级，玻璃体轻度混浊，眼底可见大血管；Ⅱ级，玻璃体中度混浊，眼底仅能看清视盘；Ⅲ级，玻璃体重度混浊，眼底无法窥入。PVR分级标准：Ⅰ级，玻璃体内可见增殖的条带，眼底正常；Ⅱ级，局灶性牵拉，局部血管改变，包括血管扩张、充血和抬高；Ⅲ级，髓线处局限性视网膜脱离；Ⅳ级，广泛视网膜脱离，髓线视网膜全脱离，乳头周围视网膜脱离；Ⅴ级，视网膜全部脱离。视网膜脱离发生率：Ⅲ～Ⅴ级PVR眼数占总眼数的百分比。
2 . 1 玻璃体及视网膜情况 对照组12眼术后各时间段玻璃体均无明显混浊，眼底视网膜在位(图1)。术后1 d：实验组1中Ⅱ级及Ⅲ级玻璃体混浊各6眼，实验组2中Ⅰ级玻璃体混浊4眼，Ⅱ级8眼。实验组1中3眼于玻璃体中后部可见灰白色增殖膜，但与视网膜无粘连，为PVR Ⅰ级；实验组2所有眼玻璃体均未见增殖膜。术后7 d：两实验组玻璃体混浊程度虽较前有所减轻，但所有24眼玻璃体均出现灰白色增殖膜，PVR成模率达100%。实验组1 中3眼仅玻璃体内可见灰白色增殖条带，与视网膜无粘连，为PVRⅠ级。实验组1中9眼增殖膜与视网膜存在粘连，其中2眼增殖膜牵拉髓线远端致血管扭曲、充血、扩张，但未发生视网膜脱离，为PVR Ⅱ级(图2)；3眼增殖膜牵拉导致髓线处视网膜血管明显抬高，发生局限性视网膜脱离，为PVR Ⅲ级(图3)，B超示视网膜前可见增殖膜，牵拉致局限性视网膜脱离(图4)；3眼视网膜表面可见大量灰白色增殖膜，牵拉导致视盘两侧髓线及周围视网膜脱离，为PVR Ⅳ级(图5)，B超示增殖膜牵拉致广泛性视网膜脱离(图6)；1眼发生视网膜全脱离，为PVR Ⅴ级。实验组2中有3眼增殖膜与视网膜无粘连；9眼增殖膜与视网膜存在粘连，其中3眼髓线处局部视网膜脱离，1眼视网膜全部脱离，余5眼未发生视网膜脱离。术后14 d ：所有眼玻璃体混浊程度均减轻，实验组1中玻璃体混浊0级8眼，Ⅰ级3眼，Ⅱ级1眼；实验组2中玻璃体混浊0级10眼，Ⅰ级2眼。两实验组PVR程度进一步加重，实验组1中1眼玻璃体增殖膜与视网膜无粘连，11眼增殖膜牵拉视网膜，其中2眼视网膜在位，2眼髓线处局部视网膜脱离，4眼视盘周围视网膜广泛脱离，3眼视网膜全脱离。实验组2中2眼增殖膜与视网膜无粘连，10眼增殖膜与视网膜相连，其中3眼视网膜在位，2眼髓线处视网膜脱离，3眼视网膜广泛脱离，2眼视网膜全脱离。所有眼B超结果与眼底检查结果一致。术后28 d： 实验组1中1眼由PVRⅡ级发展到Ⅲ级，1眼由Ⅳ级发展至Ⅴ级，实验组2中1眼由Ⅳ级发展至Ⅴ级。视网膜脱离眼数显著增加，实验组1中6眼发生全视网膜脱离，3眼发生广泛视网膜脱离，实验组2中4眼发生广泛视网膜脱离，无1眼发生视网膜全脱离。
图1 对照组彩色眼底像 ， 可见正常视盘 、 髓线及视网膜大血管
Figure 1 Fundus color photography image of control group , show the normal optic disc , medullary ray and rentinal vasculars
图 2 PVR Ⅱ 级彩色眼底像 ， 玻璃体内可见灰白条索状增殖膜 ， 并牵拉视网膜髓线远端 ， 致血管扭曲 、 充血及扩张
Figure 2 Fundus color photography image of PVR Ⅱ, show the off - white proliferative membrane which pulling the far - end of medullary ray , cause tortuosity and dilation of retinal vasculars
图 3 PVR Ⅲ 级彩色眼底像 ， 可见髓线处视网膜血管明显抬高 ， 发生局限性视网膜脱离
Figure 3 Fundus color photography image of PVR Ⅲ, show the elevation of retinal vasculars at medullary ray and local retinal detachment
图 4 PVR Ⅲ 级B超图像 ， 可见视网膜前增殖膜 ， 牵拉视网膜致局限性视网膜脱离
Figure 4 B ultrasonic image of PVR Ⅲ, show traction of the preretinal proliferative membrane and local retinal detachment
图 5 PVR Ⅳ 级彩色眼底像 ， 示视盘两侧髓线及周围视网膜广泛脱离
Figure 5 Fundus color photography image of PVR Ⅳ, show detachment of the medullary ray at optic disc and retina
图 6 PVR Ⅳ 级B超图像 ， 示增殖膜牵拉导致广泛性视网膜脱离
Figure 6 B ultrasonic image of PVR Ⅳ, show the mild retinal detachment is caused by traction of proliferative membrane
2 . 2 PVR分级及视网膜脱离发生率 对照组12眼均未发生PVR及视网膜脱离。术后1 d实验组1中3眼发生PVR Ⅰ级，实验组2所有眼均未发生PVR。术后7 d实验组1中PVR Ⅰ级3眼，Ⅱ级2眼，Ⅲ级3眼，Ⅳ级3眼，Ⅴ级1眼，实验组2中PVR Ⅰ级3眼，Ⅱ级5眼，Ⅲ级3眼，Ⅳ级1眼。术后14 d实验组1中PVR Ⅰ级1眼，Ⅱ级2眼，Ⅲ级2眼，Ⅳ级4眼，Ⅴ级3眼，实验组2中PVR Ⅰ级2眼，Ⅱ级3眼，Ⅲ级2眼，Ⅳ级3眼，Ⅴ级2眼。术后28 d实验组1中PVR Ⅱ级1眼，Ⅲ级2眼，Ⅳ级3眼，Ⅴ级6眼，实验组2中PVR Ⅰ级1眼，Ⅱ级3眼，Ⅲ级2眼，Ⅳ级2眼，Ⅴ级4眼。术后各时间段视网膜脱离发生率实验组1分别为0%、58.33%、75.0%和91.67%，实验组2分别为0%、33.33%、66.67%和66.67%。
PVR是由于各种原因导致玻璃体和视网膜前后表面形成纤维增殖膜，进而膜的收缩和牵拉引起视网膜脱离为特征的一类疾病，炎症期是其最初阶段，此时大量炎症因子释放，对RPE细胞的移行、增殖、分化等具有重要作用。由于PVR的病理过程十分复杂，涉到多种细胞因子，包括多种炎症因子、生长因子等 [4] 。最新研究表明血管内皮生长因子在外伤性增生性玻璃体视网膜病变发挥重要作用 [5] 。PVR在治疗上比较棘手，新近治疗方法包括玻璃体视网膜手术 [6] 、玻璃体注射药物 [7] 等，新近药物治疗进展即基因治疗 [8] 。
在动物体内成功建立PVR模型是研究PVR治疗方法的前提，其造模方法多种多样，单纯细胞模型包括向玻璃体腔注入RPE细胞 [9-10] 、成纤维细胞 [11] 等，其他造模方法多为联合方法，包括玻璃腔注射RPE细胞联合血小板衍生生长因子 [12] 、玻璃体腔注射富含血小板的血浆联合巩膜外冷冻 [13] 、玻璃体腔行气体压迫术后注入成纤维细胞、RPE细胞和富含血小板的血浆 [14] 。另有文献报道采用玻璃体腔注射分散酶进行造模 [15] 。单纯注入细胞的造模方法虽可达到满意的造模效果，但无法模拟PVR早期炎症阶段由于血-视网膜屏障破坏导致各种细胞因子释放的病理环境，而RPE细胞联合其他方法进行造模则更加符合PVR的病理过程。笔者的前期体外研究已证实IL-1β可以诱导RPE细胞移行、增殖和表达相关炎症因子 [3] ，故本研究采用玻璃体腔注射RPE细胞联合炎症因子IL-1β进行PVR造模，旨在更接近PVR早期病理过程，且方法简单易行，便于应用和推广。选择兔作为PVR造模动物，主要因为兔眼与人眼具有一定相似性，且便于操作和观察，加之动物来源广泛、价格低廉及造模周期适宜，是理想的造模动物。
本研究结果显示，术后1 d时实验组2尚无PVR眼发生，而实验组1已有3眼发生PVR Ⅰ级，说明RPE细胞和IL-1β联合注入玻璃体腔能明显加快成模速度；术后7 d时两实验组PVR成模率均达100%，可见2种造模方法均获得了较理想的造模效果，但实验组1 PVR发生程度更重、数量更多；此后随时间延长，2种模型PVR及视网膜脱离发生率均稳步上升，最终于术后28 d时实验组1中PVR Ⅳ级及Ⅴ级眼数均多于实验组2，2组视网膜脱离发生率分别达到93%和67%。由此可见，玻璃体腔注射RPE细胞联合IL-1β较单纯注射RPE细胞建立的PVR模型成模更早，PVR发展更快且级别更高。
本研究应用2种造模方法，术后7 d PVR发生率均达到100%，其PVR发生率无明显差异。Kosnosky等 [16] 采用玻璃体腔注射IL-1β联合制造裂孔进行PVR模型建立，结果显示术后1个月时IL-1β联合造孔组7眼中5眼发生PVR，而单纯注射IL-1β组或造孔组均无PVR发生，说明在视网膜裂孔所致的PVR形成过程中，RPE细胞的移行起到至关重要的作用，IL-1β虽然可造成早期眼内炎症反应，但在PVR病程中可能不起主要作用。但IL-1β可诱发RPE细胞的移行、增殖和分化，还可刺激RPE细胞产生其他细胞因子 [3,17-18] ，在这些因素的共同作用下，可促进眼内增殖膜的形成，从而启动了PVR的进程。
总之，采用玻璃体腔注射RPE细胞联合IL-1β的方法进行兔眼PVR模型的建立，更加接近人眼PVR发生过程，兔RPE细胞较易获得，造模过程简单易行且成功率高，是PVR体内实验研究的基础，可为深入研究PVR的防治方法提供更为有利的保障。
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LIU Li-ya, MA Jing-xue * , AN Jian-bin, MA Yue-lei
( Department of Ophthalmology , the Second Hospital of Hebei Medical University , Shijiazhuang 050000, China )
[ Abstract ] Objective To compare the time and effect of the 2 methods by using 2 methods to establish proliferative vitreoretinopathy(PVR) model in rabbit eye. Methods The experimental group was given intravitreal injection of a mixture of retinal pigment epithelium (RPE) cells and interleukin-1(IL-1) beta or simple RPE cells respectively. The control group was given intravitreal injection of normal saline, and vitreous, fundus and B ultrasonic examination were performed after operation. The degree of vitreous opacity and the degree of PVR were graded, and the incidence of retinal detachment was calculated. Results After 7 days of vitreous injection, occurrences of PVR were 100% in both of the two groups. PVR happened more earlier and faster in Group Ⅰ than Group Ⅱ. Group Ⅰ also had the higher incidence of retinal detachment. Conclusion Injective vitreous of RPE cells combined with IL-1β in rabbit eyes is the best method to establish of PVR model, and is more in line with the pathological process of PVR.
[ Key words ] vitreoretinopathy, proliferative； retinal pigment epithelium； retinal detachment
*通讯作者 。E-mail：15803210925@163.com
[作者简介] 刘丽娅(1981-)，女，天津武清人，河北医科大学第二医院主治医师，医学博士，从事眼底疾病诊治研究。
[基金项目] 河北省医学科学研究重点课题(20170074)
[修回日期] 2018-08-27
[收稿日期] 2018-08-06；
[文章编号] 1007-3205(2018)10-1201-05
[文献标志码] A
[ 中图分类号 ] R774.1
doi: 10.3969/j.issn.1007-3205.2018.10.020
(本文编辑：刘斯静)