表12组基因型分布比较
Table1Comparisonofgenotypedistributionbetweentwogroups(例数，%)
黄俊芳，黄建敏，蒙兰青，李雪斌*
(右江民族医学院附属医院神经内科，广西 百色 533000)
[摘要]目的探讨载脂蛋白E(apolipoprotein E，APOE)基因多态性、同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)对老年卒中后抑郁的预测价值。方法选取脑卒中患者109例，根据患者是否出现抑郁症分为脑卒中组(65例)与脑卒中后抑郁组(44例)。检测2组APOE基因多态性(包括基因型分布与等位基因ε2、ε3、ε4频率)和血清Hcy水平。比较2组ε2/ε2、ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε3、ε3/ε4、ε4/ε4基因型分布，等位基因ε2、ε3、ε4频率，血清Hcy水平，计算不同基因型预测老年卒中后抑郁的敏感度，绘制血清Hcy预测卒中后抑郁的受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线。结果2组基因型均以ε3/ε3最常见，6种不同基因型分布差异无统计学意义(P>0.05)。2组ε2与ε3基因频率差异无统计学意义(P>0.05)，脑卒中后抑郁组ε4基因频率高于脑卒中组，差异有统计学意义(P<0.05)。不同基因型中，ε4/ε4预测老年脑卒中后抑郁的敏感度最高，为83.33%(5/6)。脑卒中后抑郁组血清Hcy水平高于脑卒中组，差异有统计学意义(P<0.05)。2组不同基因型患者血清Hcy水平差异无统计学意义(P>0.05)。血清Hcy水平预测老年脑卒中后抑郁的ROC曲线下面积为0.744，敏感度为64.70%，特异度为81.20%，临界值为18.455 μmol/L。结论APOE基因多态性与血清Hcy可作为老年脑卒中后抑郁的预测指标，从而为老年脑卒中患者的干预提供参考，以降低脑卒中后抑郁发生率。
[关键词]卒中；抑郁；载脂蛋白E类；半胱氨酸 doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2018.11.005
抑郁症是以情感低落或兴趣减退并伴认知、行为紊乱与躯体症状的精神类疾病，普通人群的患病率为10%～15%[1]。据报道，抑郁也是脑卒中患者的常见并发症，发生率达20%～79%[2]。脑卒中后抑郁的发生不仅会延长患者康复时间、降低生活质量，甚至可能增加致残率、病死率，故采取有效指标对脑卒中后抑郁进行预测具有重要临床意义。同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)为体内正常代谢产物，与脑血管疾病、肿瘤等有密切关系，且与抑郁呈正相关[3]。国外有研究发现，脑卒中后抑郁与阿尔茨海默病在临床观察、病理学、神经生化学及神经影像学检查等方面均存在相似之处，而载脂蛋白E(apolipoprotein e，APOE)基因多态性是阿尔茨海默病的重要危险因素，故APOE基因多态性也可能是脑卒中后抑郁的潜在机制之一[4]。本研究以109例老年脑卒中患者作为研究对象，探讨APOE基因多态性、Hcy对老年脑卒中后抑郁的预测价值，报告如下。
1.1一般资料 选取2016年1月—2017年12月我院收治的脑卒中患者109例。根据患者是否出现抑郁症分为脑卒中组(65例)与脑卒中后抑郁组(44例)。脑卒中组男性31例，女性34例；年龄67～82岁，平均(72.48±4.96)岁；受教育年限3～13年，平均(6.21±2.02)年。脑卒中后抑郁组男性20例，女性24例；年龄66～84岁，平均(73.01±5.21)岁；受教育年限4～15年，平均(7.11±2.38)年。2组性别、年龄、受教育年限差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。
本研究获医院伦理委员会批准通过。
脑卒中后抑郁诊断标准包括5项。A(符合第1条或第2条外加其他任意2条，且持续1周以上)：①经常性情绪低落；②对日常活动丧失兴趣；③精神运动性迟滞或激越；④精力明显减退，无原因疲乏感；⑤自我评价过低；⑥反复出现想死的念头或自杀行为；⑦睡眠异常；⑧食欲不振。B：相关症状致患者痛苦，或导致职业、社交等方面损害。C：1年内有卒中病史。D：排除服药、吸毒、酗酒等原因或其他躯体疾病引起的精神障碍(如适应障碍伴抑郁心境)。E：排除其他重大生活事件引起精神障碍(如离婚、丧偶)。同时满足A-E即可确诊。
纳入标准：①首诊发病患者，符合第四次全国脑血管病学术会议制定的脑卒中诊断标准要点，经头颅CT或MRI证实；②经治疗后意识转清楚；③年龄>65岁；④对研究知情，签署知情同意书。排除标准：①伴功能性精神障碍、功能性抑郁症及其他类型精神障碍者；②既往有抑郁病史及器质性精神疾病史者；③伴严重躯体疾病、血液系统疾病者；④伴神经系统疾病(如中风与痴呆)者；⑤伴药物、酒精及物质依赖者；⑥入组前1年内有重大精神创伤史者。
1.2APOE基因多态性检测 空腹抽取3 mL外周静脉血，置于EDTA抗凝管，进行 APOE基因多态性检测。
1.2.1提取基因组DNA 采取改进碘化钾法，先移取500 μL样品至离心管中，加入1 000 μL无菌水充分振荡；常温下离心5 min，13 000 r/min，弃去上清液；加入5 mol/L碘化钾溶液150 μL，漩涡振荡60 s，室温静置2 min以上；加入0.9%NaCl溶液550 μL与1 000 μL酚/氯仿/异戊醇(体积比15∶34∶1)，混匀后静置2 min；常温13 000 r/min离心5 min，将上层清液到吸到新的离心管中；加入400 μL异丙醇，混匀后静置2 min；常温13 000 r/min离心5 min，弃去上清液；加入70%乙醇1 000 μL，混匀；常温13 000 r/min离心8 min，弃去上层清液，置于37 ℃烘箱中烘干；加入1×TE缓冲液100 μL，振荡1 min 后离心，37 ℃水浴锅中过夜溶解；微波炉内加热溶解1%琼脂糖凝胶80 mL，待冷却至50 ℃左右时加溴化乙锭至1 mg/L，混匀后制胶，室温放置30 min。将2 μLDNA溶液与适量6×加样缓冲液混合，上样。1×TE溶液作电泳缓冲液，150 V电泳30 min，用TE缓冲液稀释DNA至终浓度约为100 mg/L的工作液。
1.2.2测定DNA浓度 取4 μL基因组DNA样品，去离子水稀释25倍，吹打混匀。紫外分光光度计调零，DNA样本放入比色杯中，测定浓度、质量和OD260/280。
1.2.3PCR扩增 APOE基因引物序列：上游：5′-TCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCA-3′，下游5′-ACAGAATTCGCCCCGGCCTGGTACACTGC-CA-3′，由上海英俊生物技术有限公司合成。10 000 r/min离心固体引物，加入去离子水，充分振荡、混匀，引物稀释浓度100 pmol/L，-20 ℃冷藏。引物稀释液在PCR扩增前稀释为20 pmol/L。PCR体系：10×PCR反应缓冲液，包括10%DMSO2.5 μL，25 mmol/L MgCl21.5 μL，DNA模板1.0 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL， 20 pmol/L上游引物序列0.5 μL，20 pmol/L下游引物序列0.5 μL，Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，加入去离子水使总体积为25 μL。扩增后酶切体系：PCR产物10 μL，HhaⅠ(10 U/μL)10 μL，加入去离子水使总体积为30 μL，混匀后置于37 ℃水浴中消化过夜。反应结束后酶切产物用12%聚丙烯酰胺凝胶电泳确定基因型。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性 30 s，65 ℃退火30 s，70 ℃延伸90 s，共40个循环，72 ℃延伸10 min。结束反应后PCR产物用1.5%琼脂糖电泳观察扩增效果。APOE基因在rs429358与rs7412位有等位基因ε2、ε3、ε4，共6种基因型。等位基因频率=[(2×纯合子+杂合子)÷(2×受检总例数)]×100%。
1.3血清Hcy检测 空腹状态下取2 mL外周静脉血，3 000 r/min离心15 min，采用透射免疫比浊法，用美国贝克曼公司生产的全自动免疫分析仪，检测试剂盒购自贝克曼公司原装试剂盒。
1.4观察指标
1.4.1基因型分布 比较2组ε2/ε2、ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε3、ε3/ε4、ε4/ε4的分布情况。
1.4.2等位基因频率 比较2组等位基因ε2、ε3、ε4的频率。
1.4.3血清Hcy水平 比较2组血清Hcy水平及不同基因型患者血清Hcy水平。
1.5统计学方法 应用SPSS 19.0统计软件分析数据。计量资料比较采用两独立样本的t检验；计数资料比较采用χ2检验；APOE基因多态性预测计算老年卒中后抑郁的敏感度，血清Hcy水平预测绘制老年脑卒中后继发抑郁的受试者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲线。P<0.05为差异有统计学意义。
2.12组基因型分布比较 2组基因型均以ε3/ε3最常见，6种不同基因型分布差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。
表12组基因型分布比较
Table1Comparisonofgenotypedistributionbetweentwogroups(例数，%)
2.22组等位基因频率比较 2组ε2与ε3基因频率差异无统计学意义(P>0.05)；脑卒中后抑郁组ε4基因频率高于脑卒中组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。
2.3APOE基因多态性对老年脑卒中后抑郁的预测分析 ε2/ε2预测老年脑卒中后抑郁的敏感度为0；ε2/ε3预测敏感度为42.86%(9/21)，ε2/ε4预测敏感度为33.33%(2/6)，ε3/ε3预测敏感度为35.29%(18/51)，ε3/ε4预测敏感度为50.00%(10/20)，ε4/ε4预测敏感度为83.33%(5/6)。
2.4血清Hcy水平比较 脑卒中后抑郁组血清Hcy水平高于脑卒中组，差异有统计学意义(P<0.05)； 2组不同基因型患者血清Hcy水平的差异无统计学意义(P>0.05)。见表3，4。
表22组等位基因频率比较
Table2Comparisonofallelefrequenciesbetweentwogroups(基因数，%)
表32组血清Hcy水平比较
Table3ComparisonofserumHcylevelsbetweentwogroups
±s，μmol/L)
表42组不同基因型患者血清Hcy水平比较
Table4ComparisonofserumHcylevelsintwogroupsofpatientswithdifferentgenotypes±s，μmol/L)
2.5血清Hcy水平预测老年脑卒中后抑郁的ROC曲线 血清Hcy水平预测老年脑卒中后抑郁的ROC曲线下面积为0.744，敏感度为64.70%，特异度为81.20%，临界值为18.455 μmol/L(图1)。
图1血清Hcy预测老年脑卒中后抑郁的ROC曲线
Figure1ROCcurveofserumHcypredictingelderlypost-strokedepression
目前，国内外对脑卒中后抑郁的诊断仍比较滞后，主要依赖患者的临床表现，缺乏脑卒中后抑郁的客观预测手段。有学者认为，可根据抑郁的发病机制寻找可靠指标对脑卒中后抑郁进行预测[5-6]。
张国平等[7]研究显示，血清Hcy水平与抑郁发生有一定的关系。本研究结果显示，脑卒中后抑郁组患者血清Hcy水平明显高于脑卒中组，推测血清Hcy水平升高可能是抑郁的诱发因素之一。Hcy为人体甲硫氨酸循环的中间产物，对维持人体平衡意义重大。Hcy升高为抑郁的高危因素[8]。Hcy可通过多个途径增加卒中后抑郁风险：①Hcy升高往往发生相应的S2腺苷甲硫氨酸减少，无法维持甲基化代谢，使甲基化物含量下降，进而抑制肾上腺素生成，而肾上腺素与抑郁之间密切相关；②Hcy升高会引起磷酸肌酸和肌酸减少，而二者是脑部代谢平衡的关键，故Hcy升高会诱发脑部代谢不足而造成脑损伤[9-10]。本研究ROC模型分析结果显示，当血清Hcy=18.455 μmol/L时，预测抑郁的敏感度达64.70%，证实其可成为脑卒中后抑郁的有效预测指标。
APOE是由单一多肽链构成的多肽，存在于多种脂蛋白颗粒中，在肝内及脑中均有APOE mRNA分布。现有证据表明，APOE 可调节脂质代谢、维持胆固醇平衡，也参与神经系统生长和损伤后修复[11-12]。有研究发现，APOE基因多态性与抑郁的发生有关，是抑郁症的潜在危险因子[13]。动物研究发现，APOE有 3 种异构体，分别为ε2、ε3、ε4，其中ε4等位基因可引起代谢紊乱，是脑梗死发病的遗传易感因子[14]。本研究结果显示，2组不同基因型分布差异无统计学意义，但脑卒中后抑郁组的ε4基因频率高于脑卒中组(P<0.05)，ε4/ε4预测老年脑卒中后抑郁的敏感度为83.33%(5/6)。表明ε4等位基因与抑郁之间存在某种联系，但详细机制尚不明确，推测与脑卒中后抑郁的内源性机制学说有关[15-16]，如ε4等位基因可影响机体代谢，诱导脑血管动脉粥样硬化，使脑血管供血不足，损伤情感调节区域或阻断相关通路，从而影响相关神经调节因子的分泌。笔者认为，可将血清Hcy与APOE基因多态性作为老年脑卒中后抑郁的预测指标，对于血清Hcy>18.455 μmol/L且APOE基因ε4/ε4的患者，应重点关注，并予以积极干预，预防抑郁的发生。
综上所述，血清Hcy与APOE基因多态性预测老年脑卒中后抑郁的风险具有较大临床价值，对于老年脑卒中患者，可通过血清Hcy及APOE基因多态性检测进行有效干预，以降低抑郁发生风险。
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HUANG Jun-fang, HUANG Jian-min, MENG Lan-qing, LI Xue-bin*
(DepartmentofNeurology,AffiliatedHospitalofYoujiangMedicalUniversityforNationalities,Baise533000,China)
[Abstract]ObjectiveTo investigate the predictive value of apolipoprotein E(APOE) gene polymorphisms and homocysteine(Hcy) on post-stroke depression in the elderly.MethodsA total of 109 stroke patients admitted were selected and divided into stroke group(65 cases) and post-stroke depression group(44 cases) according to whether the patient had depression. Both groups were tested for APOE polymorphisms(including genotype distribution and allele ε2, ε3, ε4 frequencies) and serum Hcy levels. The genotype distributions of ε2/ε2, ε2/ε3, ε2/ε4, ε3/ε3, ε3/ε4, ε4/ε4, the frequencies of alleles ε2, ε3, ε4, serum Hcy levels were compared between the two groups. Different genotypes were calculated to predict the sensitivity of post-stroke depression in the elderly. The sensitivity of post-stroke depression was plotted and the receiver operating characteristic(ROC) curve was plotted for serum Hey to predict post-stroke depression.ResultsThe genotypes of the two groups were most common with ε3/ε3, and the distribution of the six different genotypes was not statistically significant(P>0.05). There was no significant difference in the frequency of ε2 and ε3 gene between the two groups(P>0.05). The frequency of ε4 gene in the post-stroke depression group was higher than that in the stroke group(P<0.05). Among different genotypes, the ε4/ε4 had the highest sensitivity of 83.33%(5/6) to predict post-stroke depression. The serum Hcy levels in the post-stroke depression group were higher than those in the stroke group(P<0.05). There were no significant difference in serum Hcy levels in different genotypes between the two groups(P>0.05). The serum Hcy level predicts ROC curve area for post-stroke depression in the elderly with 0.744, a sensitivity of 64.70%, a specificity of 81.20%, and a critical value of 18.455 μmol/L.ConclusionThe serum homocysteine and APOE gene polymorphisms can be used as predictors of post-stroke depression in elderly stroke patients and provide references for elderly stroke patients to reduce the incidence of post-stroke depression.
[Keywords]stroke； depression； apolipoproteins E； cysteine
*通讯作者。E-mail：zhaxdra@163.com
[作者简介]黄俊芳(1980-)，女，广西百色人，右江民族医学院附属医院主治医师,医学硕士，从事神经内科疾病诊治研究。
[基金项目]国家自然科学基金(81160146)
[修回日期]2018-08-13
[收稿日期]2018-07-05；
[文章编号]1007-3205(2018)11-1257-05
[文献标志码]A
[中图分类号]R743
(本文编辑：赵丽洁)