李鹏涛1，高志红1，段晓亮2，张晓丽3，张 辉3*
(1.河北北方学院研究生学院，河北 张家口 075000；2.冀中能源峰峰集团总医院骨一科，河北 邯郸 056200；3.河北北方学院基础医学院，河北 张家口 075000)
[摘要]目的探讨黄芪甲苷Ⅳ可以体外诱导SAMR1小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)分化为神经细胞，证明其诱导作用对Notch-1和β-catenin的影响。方法采用全骨髓贴壁培养法培养SAMR1小鼠的BMSCs；流式细胞技术检测其CD29，CD34，CD90的表达；以0,20,40,80,160,320 g/L浓度黄芪甲苷Ⅳ诱导BMSCs，分别在0，1，6，12，24，48，72 h免疫荧光检测其NSE和Nestin的表达；Western blot检测诱导过程中Notch-1和β-catenin蛋白的表达；应用RT-qPCR检测诱导后Nestin、NSE、Notch-1、β-catenin mRNA的表达。结果SAMR1小鼠BMSCs培养至第3代，细胞基本呈长梭形，细胞体积增大，基本纯化；流式细胞技术检测CD29(+)、CD34(-)、CD90(+)，证实其为BMSCs；通过对不同浓度诱导效果的统计分析得出，20,40,80 g/L黄芪甲苷Ⅳ诱导组(T1，T2，T3)诱导后，NSE和Nestin表达明显高于对照组，在组间、时点间、组间·时点间交互作用差异均有统计学意义(P<0.05)，160,320 g/L(T4，T5)浓度组细胞出现死亡现象；诱导后1 h细胞开始表达NSE和Nestin，48 h后诱导效果明显下降， 6，12，24 h诱导效果较好，也无明显差异；40 g/L组诱导12 h神经细胞表达量最高。Western blot检测结果显示，诱导组Notch-1蛋白表达低于对照组，诱导组β-catenin 蛋白表达显著高于对照组；RT-qPCR结果显示，诱导后Nestin、NSE mRNA表达高于对照组(P<0.05)，诱导组Notch-1 mRNA表达低于对照组(P<0.05)，诱导组β-catenin mRNA表达高于对照组(P<0.05)。结论黄芪甲苷Ⅳ可以诱导SAMR1小鼠BMSCs体外分化为神经细胞， 40 g/L浓度诱导12 h效果较好。黄芪甲苷Ⅳ诱导分化过程中，通过提高β-catenin蛋白和mRNA的表达，抑制Notch1蛋白和mRNA的表达，从而促进BMSCs分化为神经细胞。
[关键词]阿尔茨海默病；间充质干细胞；小鼠 doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2018.11.023
阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD)是一种以认知和记忆功能损害为特征，具有一定遗传倾向的中枢神经系统退行性疾病，并且患病率呈持续上升趋势[1-2]。随着人口老龄化程度的不断加剧，使得严重影响老年人生活质量的AD备受关注。目前，临床治疗AD的主要措施是控制AD症状及延缓病程，尚无有效的办法。新兴的细胞移植治疗方法，给AD的治疗提供了新的契机。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有易获得、成本低、排斥反应小及诱导分化效果好等优点，已有研究证实BMSCs移植可明显改善AD模型大鼠的症状。快速老化模型小鼠(senescence accelerated mouse,SAM)是从AKR/J系小鼠中培育出的快速老化模型，它具备稳定的老化病态特征和均一的遗传背景。SAMR1各项生理指标及生存期限与正常动物相似，常作为SAMP8的正常对照。黄芪作为我国常用的传统中药之一，基础研究证实它对AD具有一定的治疗效果，黄芪甲苷Ⅳ是黄芪的主要有效成分。本研究旨在证实黄芪甲苷Ⅳ可以诱导SAMR1小鼠BMSCs分化为神经细胞，确定诱导的最佳浓度和时间，并探讨黄芪甲苷Ⅳ诱导分化过程对Notch-1、β-catenin表达的影响。
1.1动物来源 SAMR1小鼠(SCXK(京)2016-0010)，SPF级，雄性，4周龄，体重20～25 g，购于北京大学实验动物科学部。
1.2主要试剂 DMEM、胎牛血清(gibco公司)；黄芪甲苷Ⅳ(sigma公司)；Anti-mouse CD34FITC、Anti-mouse CD29FITC、 Anti-mouse CD90 PE(Thermo Fisher公司)；Anti-NSE、Anti-nestin、Anti-Notch-1、Anti-βcatenin、Anti-βactin、Anti-rabbit IgG/HRP 、Goat Anti-rabbit IgG FITC、Goat Anti-rabbit IgG/Cy3、DAPI(Bioss公司)；SDS-PAGE凝胶试剂盒、4×蛋白质上样缓冲液、蛋白抽提试剂(Solarbio公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(Bio Tool)；Trizol(invitrogen公司)；SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)、FastQuant RT Kit(TIANGEN)。
1.3试验方法
1.3.1BMSCs培养 将SAMR1小鼠脱臼处死，75%酒精浸泡10 min，无菌条件下取小鼠胫腓骨，去除肌肉组织，用DMEM(含15%胎牛血清)充分冲洗骨髓腔，用7号针头将细胞吹打成单细胞悬液，以1×109/ L浓度接种于培养瓶中，置于37 ℃，5% CO2培养箱中，48 h首次换液，以后每2天换液1次，待细胞容合率达80%～90%时，去掉培养基，PBS洗1次，加入含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化细胞，胎牛血清终止消化，充分吹打细胞并收集细胞悬液，1 500 r/min离心5 min，去上清，调整细胞浓度1×105浓度接种到培养瓶中，传至三代备用。
1.3.2流式细胞仪检测细胞免疫表型 取三代BMSCs，胰蛋白酶消化细胞，收集细胞，1 500 r/min离心5 min，去上清，PBS浸洗3遍，调整细胞浓度1×106置于5支流式管中，依次加入PBS、CD34FITC、CD29FITC、CD90 PE，PBS为对照。4 ℃避光30 min，离心弃上清，PBS浸洗2次，每管中加入500 μL PBS吹打成单细胞悬液，上流式细胞仪检测。
1.3.3黄芪甲苷Ⅳ诱导分化的BMSCs免疫细胞荧光检测 取黄芪甲苷Ⅳ(40 g/支)与DMEM(含15%胎牛血清)配置成0(C)，20(T1)，40(T2)，80(T3)，160(T4)，320(T5) g/L浓度的诱导培养基备用。取三代BMSCs，胰蛋白酶消化收集细胞，调整细胞浓度1×105浓度接种于事先放置盖玻片的24孔板中，待细胞融合率达70%～80%，加入不同浓度的诱导培养基，分别于0，1，6，12，24，48，72 h取各组BMSCs细胞爬片，PBS洗3次，加入4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次，滴加山羊血清，室温封闭30 min，吸掉封闭液，不洗，滴加1∶300稀释的一抗，放入湿盒，4 ℃过夜。次日，复温30 min，PBS-T浸洗玻片3遍，滴加1∶300稀释荧光二抗(此后均在避光处进行)，湿盒中37 ℃孵育1 h，PBS-T浸洗玻片3次，滴加DAPI复染核，避光孵育5 min，PBS-T浸洗4遍，吸水纸吸干多余液体，用抗荧光猝灭的封片剂封片，共聚焦显微镜采集荧光图像，每组细胞40倍镜下选取9个视野进行阳性细胞计数分析。
1.3.4Western blot检测BMSCs诱导分化后Notch-1、β-catenin蛋白的表达 取三代BMSCs细胞，待细胞融合率达70%～80%，加入最适浓度黄芪甲苷Ⅳ进行诱导，对照组加正常培养基，诱导后提取各组细胞总蛋白，BCA上样检测蛋白浓度，经5%、12%凝胶电泳分离蛋白，每孔加15 μg蛋白，电转膜将蛋白条带转到PVDF膜上，2%脱脂奶粉摇床上封闭2 h，加Rabbit Anti-Notch-1、Anti-βcatenin、Anti-βactin一抗，4 ℃过夜，PBS-T充分洗涤后，加Goat Anti-rabbit IgG/HRP二抗，室温孵育2 h化学发光显色拍照记录，每组实验重复2次，蛋白条带用Image J软件进行吸光密度计数分析，结果用与内参比值的灰度值比表示。
1.3.5RT-qPCR检测Nestin、NSE、Notch-1、β-catenin mRNA的表达 提取诱导后诱导组和对照组细胞的总RNA，按照试剂盒说明及引物的反应条件进行反转录和目的基因Nestin、NSE、Notch-1、β-catenin扩增，β-actin为内参(表1)，采用ABI7300 Real-Time检测仪完成Q-PCR，反应体系参照Yu等[3]方法。通过溶解曲线判定扩增产物特异性，以2-ΔΔCT方法计算mRNA的相对转录水平。进行数据分析。
表1RT-qPCR引物
1.4统计学方法 应用SPSS 19.0统计软件分析数据。计量资料比较分别采用重复测量的方差分析和两独立样本的t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1BMSCs形态学观察 使用倒置显微镜观察培养瓶中原代BMSCs呈圆形，12 h后明显贴壁，24 h后细胞贴壁完成，大部分细胞呈短梭形，部分呈三角形及不规则形；首次换液后细胞生长迅速，逐渐呈长梭形，二、三代细胞呈长梭形，细胞体积增大(图1)。
2.2BMSCs表面抗原鉴定 流式细胞仪对BMSCs表面抗原进行检测结果显示， CD29表达阳性(89.0%)，CD34表达阴性(0.2%)，CD90表达阳性(96.0%)，结果显示所测细胞为BMSCs(图2)。
图1倒置显微镜下观察BMSCs形态
A.P0代4 d;B.P1代4 d;C.P2代5 d;D.P3代4 d
图2BMSCs流式细胞术检测其抗体表达
P2 CD29 FITC表达率为89%，P3 CD34 FITC表达率为0.2%，P4 CD90 PE阳性率为96.0%
2.3黄芪甲苷Ⅳ诱导后Nestin、NSE的表达 通过对不同时间不同浓度黄芪甲苷Ⅳ诱导BMSCs后NSE、Nestin表达检测发现，20，40，80 g/L浓度黄芪甲苷分别在6，12，24 h诱导效果好，在组间、时点间、组间·时点间交互作用差异均有统计学意义(P<0.01)，见表2，3。
表2黄芪甲苷Ⅳ诱导后NSE表达(n=9，
±s，%)
表3黄芪甲苷Ⅳ诱导后Nestin表达(n=9，±s，%)
160，320 g/L浓度1，6 h诱导效果明显，12 h及超过12 h细胞出现死亡现象。黄芪甲苷Ⅳ浓度40 g/L(T2)诱导12 h后细胞形态呈现不规则形，相互之间形成网状，呈现为神经细胞的形态特征(图3)。
图3黄芪甲苷Ⅳ40g/L诱导12h后细胞NSE和Nestin表达
2.4黄芪甲苷Ⅳ诱导BMSCs后Notch1、β-catenin蛋白的表达 40 g/L黄芪甲苷Ⅳ诱导后12 h诱导结果较好，诱导12 h后诱导组Notch1的蛋白表达量显著低于对照组(P<0.05)，β-catenin蛋白的表达量显著高于对照组(P<0.05)，见表4。
表4对照组与诱导组Notch-1、β-catenin蛋白表达比较(n=3，±s)
2.5黄芪甲苷Ⅳ诱导BMSCs后Nestin、NSE、Notch-1、β-catenin mRNA的表达 经40 g/L黄芪甲苷Ⅳ诱导后12 h，诱导组Nestin、NSE、β-catenin mRNA表达均高于对照组(P<0.05)，Notch-1 mRNA表达低于对照组(P<0.05)，见表5。
表5对照组与诱导组Nestin、NSE、Notch-1、β-cateninmRNA表达比较(n=3，±s)
AD被认为是引发神经认知功能障碍最常见的原因，严重影响老年人的生活质量，成为一种日益迫切的全球公共卫生、社会、政治和经济问题。AD具有一定的遗传性，目前临床尚无治愈的方法，治疗主要为控制病程的发展或减轻症状。AD的发病机制尚不十分清楚，除研究最多的β淀粉样蛋白沉积和tau蛋白过度磷酸化以外[4]，最新研究表明AD的发病与抑郁有关。Quattropani等[5]研究显示，抑郁发作的频率和严重程度与痴呆的发生风险相关。Z
dori等[6]研究表明，AD的病理机制涉及线粒体紊乱、谷氨酸兴奋毒性和神经炎症。
AD治疗除了传统的临床药物治疗之外，近期Szablewski等[7]研究表明，调节肠道微生物群的组成，也可以降低发生AD的风险，减缓AD的进展。Fang等[8]的研究表明，抗神经炎性药物治疗AD有效。最新研究显示，回忆疗法、新的药物、中医针灸疗法及纳米疗法等，对AD有一定的治疗意义[9]。随着干细胞研究的兴起，干细胞移植治疗各种疾病逐渐应用于临床，干细胞在治疗神经系统疾病中的疗效已得到证实，如干细胞在治疗多发性硬化症、亨廷顿病等方面表现出良好的治疗效果[10]。BMSCs可分化为神经细胞已得到证实，因其具有易获得、移植排斥反应小、分化效果好等优点，是目前研究较多的干细胞之一。在基础研究中，BMSCs移植治疗AD模型动物已得到证实，为治愈AD提供了新的契机。最近，de Godoy等[11]研究表明，MSC及MSC衍生的细胞外囊泡，可保护神经元免受β淀粉样蛋白诱导的氧化应激和突触损伤。衰老过程是遗传因素和环境因素共同作用的结果。目前，关于衰老过程的分子机制尚未明确。衰老的主要特征是随年龄的增加使生理完整性丧失，容易导致功能受损和易患疾病程度增加[12]。SAM是AKR/J家族自交系小鼠，其中包括9个衰老倾向系小鼠(senescence-accelerated mouse prone,SAMP)和4个抗衰老倾向系小鼠(senescence-accelerated mouse resistance,SAMR)[13]。SAMR系小鼠表现出正常衰老特征，而SAMP系小鼠表现出快速老化表型，如寿命缩短及各种老年病理变化特征[14]。目前，SAMP系小鼠已成为研究AD的模型小鼠。随着细胞移植研究和技术的不断发展，将正常衰老模型SAMR系小鼠的BMSCs，移植入快速老化模型SAMP系小鼠，可以为AD的治疗提供新的基础研究证据。
黄芪是中医中药传统的补气中药之一，广泛应用于临床。黄芪的主要成分是多糖、类黄酮和皂苷。研究显示，黄芪具有抗炎、抗纤维化、抗氧化、抗病毒等作用[15]；也有研究表明，黄芪可以调节局部炎症状态，增强神经再生，促进外周神经损伤的恢复[16]。黄芪甲苷Ⅳ是黄芪有效成分之一的药物纯化品，具有抑制炎症、抗氧化、抑制细胞凋亡等作用，还对心脏和肠胃有一定的保护作用[17]。在中枢神经系统中，黄芪甲苷Ⅳ已被证实可促进脑缺血再灌注损伤后的神经修复，在小鼠海马区可促进突触的生长，减缓神经萎缩和记忆力的减退[18]。Hu等[19]研究表明，黄芪甲苷Ⅳ可通过促进Notch信号通路，促进神经干细胞的增殖和分化，提高AD模型动物的学习记忆能力。
BMSCs可诱导分化为神经细胞的研究很多，但其具体的作用机制尚未明确。MiR124和Notch-1在神经细胞分化中承担着重要角色，研究表明MiR124和Notch信号之间，通过反馈作用调节周围神经的发育[20]。Jia等[21]研究显示，Notch-1信号通路在BMSCs分化为神经细胞过程中发挥重要作用，运用药物或基因沉默Notch信号通路，可促进BMSCs分化为神经元。Xing等[22]研究表明，当hMSC被诱导分化成神经细胞时，Notch信号分子表达被抑制，低水平的Notch信号被激活，有助于神经细胞的分化。Wang等[23]在ATRA诱导神经干细胞分化为神经元的实验中发现Notch-1基因表达明显下降。此外，Zhong等[24]研究显示，黄芪注射液可诱导MSCs分化为神经元样细胞，分化过程可能是通过激活Wnt信号通路介导的。研究表明，汉黄芩素通过抑制Notch-1信号传导，诱导骨髓干细胞分化为视网膜神经元样细胞[25]。本研究在检测黄芪甲苷Ⅳ诱导细胞分化中发现，BMSCs的Notch1和β-catenin的表达明显不同；Notch1蛋白和基因的表达在12 h比对照组明显下降，而β-catenin蛋白和基因表达显著上升。表明黄芪甲苷Ⅳ通过高表达β-catenin，抑制Notch1蛋白表达，促进BMSCs向神经细胞分化。
本研究针对黄芪甲苷Ⅳ是否可以在体外诱导SAMR1小鼠BMSCs分化为神经细胞及其适宜浓度和时间的实验结果表明：黄芪甲苷Ⅳ可体外诱导SAMR1小鼠BMSCs分化为神经细胞，40 g/L浓度的黄芪甲苷Ⅳ在12 h诱导效果最好，显微镜下可见神经细胞突起伸长并相互连接成网，神经细胞特异性表达的NSE和Nestin表达明显高于对照组；诱导后Nestin、NSE mRNA的表达也明显增加，证明黄芪甲苷Ⅳ可体外诱导SAMR1小鼠BMSCs分化为神经细胞；诱导后Notch-1蛋白和mRNA表达较对照组明显降低，β-catenin蛋白和mRNA显著升高，证明黄芪甲苷Ⅳ通过抑制Notch-1通道、激活β-catenin通道，促进BMSCs分化为神经细胞，将为SAMR1小鼠BMSCs移植入AD小鼠模型SAMP8小鼠海马区和治疗AD的深入研究提供理论和实验基础。
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*通讯作者。E-mail:zhanghui6312@126.com
[作者简介]李鹏涛(1991-)，男，河北邯郸人，河北北方学院研究生学院医学硕士研究生，从事神经损伤与修复研究。
[基金项目]河北省高等学校科学技术研究项目(ZD2014067)；河北北方学院创新人才培育项目(CXRC1327)
[修回日期]2018-06-04
[收稿日期]2018-04-11；
[文章编号]1007-3205(2018)11-1338-06
[文献标志码]B
[中图分类号]R745.7
(本文编辑：刘斯静)