白细胞介素4(interleukin-4,IL-4)是趋化因子家族的一种，主要由Ⅱ型辅助T淋巴细胞(Th2细胞)分泌，IL-4可以反馈刺激活化B细胞和T细胞的增殖，促进CD4+T细胞分化成Th2细胞，刺激B细胞合成免疫球蛋白E，影响自然杀伤细胞、淋巴因子激活的杀伤性细胞的应答，增强巨噬细胞杀伤肿瘤的活性，在体液免疫和适应性免疫中起重要作用。利用IL-4对原始T淋巴细胞极化作用，通过抑制或促进IL-4的产生，可以有效改变疾病的进程，这对于临床疾病的治疗有重要作用，可能成为疾病治疗的新的靶点[1-2]。IL-4在胃癌[3]、非小细胞肺癌[4]、宫颈癌[5]等多种肿瘤中表达异常，并与肿瘤预后有关[3]。人类基因多态性的研究是近年来临床医学、遗传病学和预防医学的重要内容之一，为从基因水平阐明人体对疾病、食物、毒物等异源性的易感性与耐受性、疾病临床表现的多样性及恶性肿瘤易感性等提供了理论依据。分析细胞因子基因多态性与幽门螺杆菌(H.pylori)感染及胃癌发病风险的关系，可以从基因水平评价胃癌患者发病风险，并为胃癌的免疫治疗提供理论依据。因此，本研究通过测定IL-4 rs2070874基因型及基因频率在H.pylori感染、胃癌人群及正常人群中的分布情况，探讨其多态性与胃癌发病及H.pylori感染风险的关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选择2014年8月—2016年3月在本院肿瘤外科或胃肠外科就诊的胃癌患者103例，所有病例均有明确组织病理学诊断，男性61例，女性42例，年龄28～75岁，平均(55.66±11.07)岁。H.pylori感染及非感染者均为同期健康查体人员，无心、脑、肝、肾、肺等重大疾病或其他全身性疾病。其中H.pylori(+)组105例，男性47例，女性58例，年龄27～76岁，平均(58.77±9.07)岁；H.pylori(-)组103例，男性52例，女性51例，年龄27～77岁，平均(57.88±11.27)岁。3组性别、年龄差异均无统计学意义(P<0.05),具有可比性。
1.2 方法 所有病例留空腹静脉血2 mL，二乙胺四乙酸二钾(EDTAK2)抗凝，颠倒混匀。改良碘化钾法提取外周血DNA，PCR反应体系是：模板0.5 μL，引物上下游各5 μL，PCR-pfu mix酶25 μL，水14.5 μL。共50 μL体系。PCR反应程序：① 94 ℃变性5 min；②热循环程序为94 ℃变性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，设定循环次数为39个，依据引物合成报告适当调整退火温度；③72 ℃延伸5 min。扩增产物取1.5 μL用1%琼脂糖凝胶电泳，以100～600 bp maker为参照。IL-4 rs2070874引物为：上游ATTACAACAAATTCGGACAC，下游AGCAGGAAGAACAGAGGG；产物大小为448 bp。凝胶电泳后，目的条带清晰，无杂带，故对产物进行直接测序，测序工作由北京中科希林生物有限公司完成。测序引物与PCR引物相同，采用正反双向测序。测序仪器为ABI PRISM 3730 xl。测序试剂为BigDye 3.1。测序反应：DNA模板1 μL，BigDye 4 μL，引物1 μL，去离子水4 μL。测序PCR循环条件：① 96 ℃ 1 min；②热循环程序为96 ℃，10 s,50 ℃ 5 s ，60 ℃ 4 min，循环次数为25个；③4 ℃保温。
1.3 统计学方法 应用SPSS 11.0统计软件处理数据，计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 IL-4 rs2070874基因型预测例数与实际例数比较 对IL-4 rs2070874进行Hardy-Weinberg平衡检验，各组rs2070874位点中TT、TC和CC基因型分布的实际数与预期数之间构成比差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。
表1 各组IL-4 rs2070874基因型预测例数与实际例数比较
Table 1 Balance test of expected and actual cases of IL-4 rs2070874 genotype in each group (例数)
rs2070874位点H.pylori(-)组TTTCCCH.pylori(+)组TTTCCC胃癌组TTTCCC实际数46421558331441575预测数474511484611474511χ20.7301.4434.071P0.6940.1790.131
2.2 不同人群IL-4基因型及等位基因分布 IL-4 rs2070874基因型在H.pylori(-)组和H.pylori(+)组均 以TT型为主，胃癌组以TC型为主；胃癌组TC基因型明显高于H.pylori(-)组和H.pylori(+)组；3组人群中IL-4 rs2070874位点均以T基因为高表达基因，3组人群T、C基因频率差异无统计学意义。见表2。
汉族成年人群中白细胞介素IL-4rs2070874位点C为低频率表达基因，最小基因表达频率为0.321 5。
表2 各组IL-4 rs2070874基因型及基因频率分布
Table 2 Distributions and genotypes of IL-4 rs2070874 in different groups
组别 例数rs2070874基因位点TTTCCC等位基因频率TCH.pylori(-)组10346(44.66)42(40.78)15(14.56)134(65.05)72(34.96)H.pylori(+)组10558(55.24)33(31.43)14(13.33)149(70.95)61(29.05)胃癌组 10341(39.81)57(55.34)*# 5(4.85)139(67.48)67(32.53)χ2 15.1641.681P 0.0040.432
*P<0.05与H.pylori(-)组比较 #P<0.05与H.pylori(+)组比较(χ2检验)
3 讨 论
1982年Howard发现T细胞培养上清中有一种可以促进B细胞增殖的因子，根据其功能命名为B细胞生长因子1(B cell growth factor 1，BCGF-1)；同时代的另外一些研究者称其为B细胞刺激因子1(B cell stimulating factor 1，BSF-1)。1986年IL-4基因克隆成功，国际统一命名为IL-4。人类IL-4主要由活化T细胞产生，此外活化的肥大细胞及B细胞也能分泌IL-4。IL-4是诱导型Th2细胞因子，它在调节Th1/Th2平衡、细胞增生凋亡以及炎症反应中发挥着重要作用。目前普遍认为恶性肿瘤发生部位一般常伴有炎症的发生，慢性炎症可以导致多种肿瘤尤其是消化道肿瘤的发生，与急性炎症反应不同，慢性炎症主要表现为单核细胞如巨噬细胞、淋巴细胞、浆细胞的浸润，并伴有组织损伤和修复。炎症反应在消化道肿瘤中的潜在作用使其成为肿瘤研究中的热点之一。
生物大分子的生成依靠其转录基因的表达与活化，在转录基因活化初始阶段启动子与目标基因的结合是转录的早期步骤，影响启动子与转录基因结合的因素可能影响最终该基因的活化或转录活性，IL-4 rs2070874位于该基因启动子与转录因子的结合部位，故该位点的多态性可能影响IL-4基因的启动或转录活性，并可能改变其表达及与其有关的其他因子的表达，从而影响与其相关的信号通路蛋白的表达，改变某些疾病的发生发展，增加疾病的易感性。
我国目前有关IL-4 rs2070874与胃癌的相关性研究较少。吴娟[6]报道IL-4 rs2070874位点TT、TC及CC基因型在胃癌患者中分别为71.4%、26%、2.6%，在贲门癌病例中为74.2%、23.3%、2.5%，在非贲门癌患者中为68.3%、29.3%、2.4%,在对照组中则分别占67.6%、30.2%、2.2%；在所有人群中该位点的基因型均以TT型为主，该位点携带TC/CC的男性贲门癌患病风险降低(校正OR=0.77,95%CI=0.61～0.97)，但在非贲门癌中没有发现这种关联性。同时期的路滟[7]也发现贲门癌患者IL-4 rs2070874 位点C等位基因有较高表达，而C等位基因携带者患贲门癌的风险降低，比T等位基因携带者风险降低27%(调整OR=0.73,95%CI=0.56～0.95)；从基因型分析发现与携带纯合子野生基因型TT的个体相比，杂合子TC基因型携带者患贲门癌的风险降低30%(调整OR=70,95%CI=0.54～0.92)，但是纯合子CC变异基因型携带者发生贲门癌的风险并没有明显降低(调整OR=1.11,95%CI=0.52～2.37)。本研究结果显示，IL-4 rs2070874基因型在胃癌组以TC型为主(55.34%)，而在H.pylori(+)组及H.pylori(-)组均以TT型为主分别为55.24%、44.66%，胃癌组TC基因型明显高于H.pylori(-)组和H.pylori(+)组，基因型分布差异均有统计学意义(P<0.05)；3组人群该位点基因型以TT或TC型为主，等位基因均以T基因为高表达基因，频率分别为67.48%、70.95%、65.05%，但3组人群T、C基因频率差异无统计学意义(P>0.05)。对于整个人群来看，IL-4 rs2070874 位点的等位基因的结果均以T基因为主，基因型则以TT或TC为主。本研究结果与吴娟、路滟等[6-7]的结果有较大差异，这可能与样本选择或地区差异有关，具体原因需要更多的研究。
有关IL-4的rs2243250基因多态性与临床疾病的研究存在较多差异。2015年，Chang等[8]对台湾地区358例肺癌患者和716例健康对照的研究发现，台湾地区IL-4 rs2243250基因多态性与肺癌有关，而rs2243248和rs2070874与肺癌无关。Zhen等[9]对IL-4的几个多态性位点与癌症的研究进行了荟萃分析，其中有关IL-4 rs2070874的研究，包括6篇研究报告，2 052例样本，总体分析发现IL-4 rs2070874基因多态性与癌症发生风险没有关系，但是对对照或种族进行分组分析则发现，IL-4 rs2070874基因多态性在白种人中与癌症发生风险有关(A基因与G基因相比:OR=1.18,95%CI 1.03～1.35,P异质性=0.621,P=0.017;AA基因型与AG/GG基因型相比：OR=1.23,95%CI 1.03～1.47,P异质性=0.196,P=0.024)，而在亚洲人中则没有发现这种关联，提出A等位基因的多态性在IL-4 rs2070874基因可能是白种人癌症发生的风险因素。IL-4 rs2070874基因多态性还可能与过敏性疾病[10]、哮喘[11]、疟疾[12]等有关。
李莹等[13]对云南汉族人群IL-4的6个多态性位点[-1138A/G(rs2243247)、-1098G/T(rs2243248)、-589C/T(rs2243250)、-33C/T(rs2070874)、2979C/A(rs2227284)、3′端C/T(rs2243292)]进行分析，发现这几个位点与HCV慢性感染无相关性。而Zhang等[14]则对PubMed、Embase、CBM、CNKI、万方数据库的相关文献进行荟萃分析，纳入了11项病例对照研究，其中胃癌患者2 247例，对照组3 370例，结果显示IL-4 rs2243250基因多态与胃癌易感性之间无显著关联，而与特应性皮炎的风险增加相关。IL-4 rs2070874 CC基因型增加中国人群中慢性乙型肝炎的风险[15]。研究表明IL-4对于体液免疫和细胞免疫均可发挥重要作用，它可刺激B细胞合成免疫球蛋白E并影响杀伤性细胞对IL-2的应答，同时影响自然杀伤细胞和巨噬细胞杀伤肿瘤的活性。H.pylori感染和胃癌发生过程中，多种细胞因子参与并发挥重要作用，而基因多态性在人群中H.pylori感染和胃癌的影响也得到了更多的研究，细胞因子在癌症免疫治疗中的作用得到了临床肯定和应用。自上世纪80年代以来，多种细胞因子在肿瘤临床研究或治疗中得到应用或试用，如IL-2、IFN、GM-CSF、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α等。IL-6的研究主要集中在其基因启动子区的-174G>C、-572C>G及-634C>G位点[16]；IL-10的研究主要集中在rs1800871、rs1800872位点[17]。从基因水平寻找疾病与相关基因的关系及定位是目前疾病治疗的方向之一，这为揭示多种疾病的易感性及从基因水平诊断治疗疾病提供了理论依据。
目前，我国有关IL-4 rs2070874与癌症的研究较少[18-21]，病例也较少，故尚需要更多的研究，以便从基因水平评估这此疾病，并为其治疗提供理论依据。
(志谢：本研究在实验设计、测量及论文撰写过程中，得到了河北师范大学生命科学院赵宝华教授的大力支持，赵老师对论文的研究方向和内容给予了方向性的建议和指导，并在论文撰写过程中提出了许多有益的意见，投入了许多心血和精力；同时生命科学院的颜琪、冯聪敏、王琳等同学在实验操作及论文撰写中均给予了大力支持和帮助。在此表示深深的谢意！)
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