UPLC-MS/MS法同时测定白蒲黄胶囊中12种有效成分

白蒲黄胶囊具有清热燥湿、解毒凉血的功效，主要由白头翁、蒲公英、黄芩和黄柏4味中药组成。其中君药白头翁药材具有清热解毒、凉血止痢的功效，临床上广泛用于免疫修饰[1]、抗氧化[2]和抗炎[3]等方面。近年来，其抗肿瘤[4-6]的作用越来越被广泛关注。但在国内市场中，白头翁药材经常与翻白草等中草药混用，造成了最终治疗效果良莠不齐。目前文献中尚未见对白蒲黄胶囊质量控制方法的报道。为进一步控制白蒲黄胶囊质量，建立一个灵敏度高、专属性好的分析方法对其进行质量控制[7]是一个亟待解决的问题。近年来，液质联用法已被广泛应用于复杂中药体系中化合物的定性、定量研究[8-15]，随着高效液相色谱技术的飞速发展，超高效液相色谱具有缩短分析时间、提升灵敏度和分辨率的优点。因此，为进一步有效控制白蒲黄胶囊的质量，本实验基于超高效液相色谱质谱联用技术，建立同时测定白蒲黄胶囊中β-蜕皮甾酮、筋骨草甾酮C、常春藤皂苷C、刺人参皂苷S、白头翁皂苷C、C47H76O17、白头翁皂苷B4、常春藤皂苷B、白头翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、23-羟基白桦脂酸和常春藤皂苷元12种成分含量的方法，旨在为白蒲黄胶囊内在质量的综合评价和全面控制提供新的方法。

1 仪器与试药

对照品β-蜕皮甾酮、筋骨草甾酮C、刺人参皂苷S、白头翁皂苷C、白头翁皂苷B4、白头翁皂苷A3、23-羟基白桦脂酸和C47H76O17均由本实验室提取分离得到，其H-NMR，C-NMR和MS等波谱数据与相关文献一致，经高效液相色谱法面积归一化法分析，其纯度大于95%。α-常春藤皂苷、常春藤皂苷元(纯度大于98%)购于上海诗丹德生物技术有限公司，常春藤皂苷C和常春藤皂苷B购于上海源叶生物科技有限公司。甲醇(色谱纯，Merck Company，Germany)；甲酸为色谱纯(色谱纯，Diamond Technology Incorporation，USA)；水为屈臣氏纯净水(屈臣氏集团有限公司，香港)；样品制备的乙醇为分析纯(天津富宇化学品公司，天津)；白蒲黄胶囊(批号：160501、160605、160609)购于黑龙江瑞格制药有限公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱为Phenomenex Kinetex-C18色谱柱(100×3 mm，2.6 mm)；柱温为40 ℃；流动相为甲醇-0.1%甲酸(A)，水-0.1%甲酸(B)，采用梯度洗脱方式，洗脱程序如下：0.0～6.0 min，60%～95% A；6.0～8.0 min，95%A等度洗脱；8.1 min，60%A；每次进样前预平衡1 min。流速为0.4 mL/min。色谱柱后溶液无分流，全部进入离子源，总体分析时间8 min，进样量2 μL。

2.2 质谱条件电喷雾离子源(ESI源)，StepWaveTM离子源，离子源温度(Source Temp)为150 ℃，毛细管(Capillary)电压为2.0 kV，离子源补偿电压(Source Offset)为50 V，脱溶剂气温度(Desolvation Temp)为500 ℃，脱溶剂气(Desolvation)流量为800 L/Hr，锥孔气(Cone)流量为150 L/Hr，雾化气(Nebuliser)压力为7.0 Bar，接口处加热，采用多反应监测模式。待测化合物中β-蜕皮甾酮，筋骨草甾酮C，常春藤皂苷C，刺人参皂苷S，白头翁皂苷C，C47H76O17采用正离子模式监测，常春藤皂苷B，白头翁皂苷A3，α-常春藤皂苷，23-羟基白桦脂酸和常春藤皂苷元采用负离子模式监测。12种目标化合物保留时间、测定离子对和质谱参数信息见表 1。

2.3.1 对照品溶液的制备分别取β-蜕皮甾酮、筋骨草甾酮C、常春藤皂苷C、刺人参皂苷S、白头翁皂苷C、C47H76O17、常春藤皂苷B、白头翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、23-羟基白桦脂酸和常春藤皂苷元对照品适量，精密称定，置于1 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，配制成一定浓度的储备液。用80%甲醇配制混合对照品溶液。其中各对照品浓度分别为β-蜕皮甾酮432.0 μg/L、筋骨草甾酮C 142.0 μg/L、常春藤皂苷C 450.0 μg/L、刺人参皂苷S 45.5 μg/L、白头翁皂苷C 104.0 μg/L、C47H76O17 565.0 μg/L、常春藤皂苷B 3 825.0 μg/L、白头翁皂苷A3 980.0 μg/L、α-常春藤皂苷265.0 μg/L、23-羟基白桦脂酸140.0 μg/L和常春藤皂苷元66.7 ng/mL。将混合对照品溶液用80%甲醇逐级稀释得到标准系列溶液。所有溶液存储于4 ℃冰箱备用。

2.3.2 供试品溶液的制备取白蒲黄胶囊内容物，约0.5 g，精密称定，置于提取瓶中，加入70%乙醇100 mL，称定重量，闪式提取处理200 s，静置至室温，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，以14 000 r/min,离心10 min，取上清液，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。浓度超出线性范围的供试品溶液用80%甲醇溶液定量稀释后依法测定。

2.4.1 线性关系考察分别精密量取混合对照品溶液，以甲醇为溶剂采用倍数稀释法分别稀释。制得6个不同浓度梯度的系列标准溶液，按上述LC-MS条件进行分析，记录各待测物的峰面积。各待测物的质量浓度X (μg/mL)为横坐标，以峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线。将混合对照品溶液逐步稀释，分别以信噪比S/N=3和S/N=10时各对照品溶液的质量浓度作为检测限和定量限。见表2。

2.4.2 精密度试验精密吸取同一混合对照品溶液各20 μL，连续进样5次，计算各成分峰面积的相对标准差(relative standard deviation，RSD)。结果β-蜕皮甾酮、筋骨草甾酮C、常春藤皂苷C、刺人参皂苷S、白头翁皂苷C、C47H76O17、白头翁皂苷B4、常春藤皂苷B、白头翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、23-羟基白桦脂酸和常春藤皂苷元的日内RSD和日间RSD分别小于3.5%和4.8%，均符合精密度试验的要求，说明该方法的精密度良好。

2.4.3 重复性试验按“2.3.2”项下方法制备白蒲黄胶囊样品(批号：160501)的供试品溶液，共5份，进样10 μL测定，记录色谱峰面积。结果β-蜕皮甾酮、筋骨草甾酮C、常春藤皂苷C、刺人参皂苷S、白头翁皂苷C、C47H76O17、白头翁皂苷B4、常春藤皂苷B、白头翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、23-羟基白桦脂酸和常春藤皂苷元含量的RSD分别为2.0%、1.6%、1.5%、3.1%、4.2%、1.7%、2.2%、3.5%、4.1%、2.9%、2.7%和3.5%。均符合规定，表明本方法重复性良好。

2.4.4 稳定性试验取同一白蒲黄胶囊(批号：160501)供试品溶液分别于0，2，6，10，12和24 h进样分析，记录峰面积。结果表明12个待测五环三萜皂苷化合物峰面积的RSD均小于4.9%，说明在室温条件下供试品溶液24 h内稳定。

2.4.5 回收率试验取白蒲黄胶囊(批号：160501)内容物细粉约0.5 g，精密称定，共6份，分别精密加入高、中、低3个浓度的12个待测化合物的对照品储备液适量，每个浓度3份，按上述方法制备供试溶液。在上述色谱条件下测定12个待测成分的峰面积并分析。结果表明平均回收率范围为97.13%～101.2%，RSD为1.2%～4.1%，说明该方法回收率良好。

2.5 样品测定取白蒲黄胶囊3批，按上述“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，记录色谱峰面积，每批样品平行测定3次，代入相应标准曲线，分别计算β-蜕皮甾酮、筋骨草甾酮C、常春藤皂苷C、刺人参皂苷S、白头翁皂苷C、C47H76O17、白头翁皂苷B4、常春藤皂苷B、白头翁皂苷A3、α-常春藤皂苷、23-羟基白桦脂酸和常春藤皂苷元的含量，见表3。

3 讨论

在正负离子模式下，分别优化12种待测成分的质谱条件。质谱结果表明化合物1～6在正离子模式下的[M+H]+离子更稳定、灵敏度更高，其他6种成分在负离子模式下有更高的响应。因此，笔者通过一次进样，在正、负离子同时检测模式下对12种活性成分进行测定，然后在MS2模式下通过调节锥孔电压和碰撞能量值，分别选择响应值较好的2个子离子峰，根据它们的响应值大小选择最佳监测离子对。

12种被测组分中有4对同分异构体，其完全分离对于精确定量具有十分重要的意义。考察不同种类的流动相(乙腈-水，甲醇-水)，不同的流速(0.5和0.4 mL/min)，不同类型的色谱柱(Waters ACQUITY BEH色谱柱，50 mm×2.1 mm，1.7 mm；Phenomenex Kinetex C18色谱柱，100 mm× 3 mm，2.6 mm)，以期在短时间内获得较好的峰形、高响应值和较好的分离度。由于目标化合物极性较小，选择甲醇-水系统作为流动相，为了获得较高的灵敏度和改善峰拖尾情况，向流动相中加入0.1%甲酸。

[1] Liu T,Ye LG,Guan XQ,et al. Immunopontentiating and antitumor activities of a polysaccharide from Pulsatilla chinensis(Bunge) Regel[J]. Int J Biol Macromol,2013,54：225-229.

[2] 连珊，江蔚新，薛睿.白头翁皂苷成分及药理作用研究进展[J].亚太传统医药，2016，12(2)：37.

[3] 杨昌文.白头翁汤及拆方对模型小鼠抗炎作用的实验研究[J].中国中医急症，2016，25(9)：1737-1739.

[4] 陈凯，张文明，喻凯，等.白头翁中抗肿瘤物质的筛选及其作用机制研究[J].天然产物研究与开发，2016，28(12)：1875-1879.

[5] 彭翠平，许琼明，张天，等.白头翁总皂苷碱水解产物的抗胶质瘤作用及机制研究[J].中药新药与临床药理，2014，25(3)：254-259.

[6] Xu QM,Shu Z,He WJ,et al. Antitumor activity of Pulsatilla chinensis (Bunge) Regel saponins in human liver tumor 7402 cells in vitro and in vivo[J]. Phytomedicine,2012,19(3/4)：293-300.

[7] 焦宁，杨劼，刘国强.中药制剂质量控制方法研究新进展[J].河北医科大学学报，2013，34(1)：120-123.

[8] Andrey Stavrianidi,Elena Stekolshchikova,Anna Porotova,et al. Combination of HPLC-MS and QAMS as a new analytical approach for determination of saponins in ginseng containing products[J]. J Pharm Biomed Anal,2017,132：87-92.

[9] Masi E,Taiti C,Heimler D,et al. PTR-TOF-MS and HPLC analysis in the characterization of saffron (Crocus sativus L.) from Italy and Iran[J]. Food Chem,2016,192：75-81.

[10] Han Y,Wen J,Zhou T,et al. Chemical fingerprinting of Gardenia jasminoides Ellis by HPLC-DAD-ESI-MS combined with chemometrics methods[J]. Food Chem,2015,188：648-657.

[11] Brkljaĉa R,Urban S. HPLC-NMR and HPLC-MS investigation of antimicrobial constituents in Cystophora monilifera and Cystophora subfarcinata[J]. Phytochemistry,2015,117：200-208.

[12] Zhang Z,Hu X,Zhang Q,et al. Determination for multiple mycotoxins in agricultural products using HPLC-MS/MS via a multiple antibody immunoaffinity column[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2016,1021：145-152.

[13] Wu Y,Jiang X,Zhang S,et al. Quantification of flavonol glycosides in Camellia sinensis by MRM mode of UPLC-QQQ-MS/MS[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2016,1017/1018：10-17.

[14] Xie Z,Mui T,Sintara M,et al. Rapid quantitation of avenanthramides in oat-containing products by high-performance liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry(HPLC-TQMS)[J]. Food Chem,2017,224：280-288.

[15] Gabrielli M,Buica A,Fracassetti D,et al. Determination of sotolon content in South African white wines by two novel HPLC-UV and UPLC-MS methods[J]. Food Chem,2015,169：180-186.

UPLC-MS/MS法同时测定白蒲黄胶囊中12种有效成分

1 仪器与试药

2 方法与结果

3 讨 论

Determination of 12 kinds of compounds in Baipuhuang capsules by UPLC-MS/MS

3 讨论