慢性鼻窦炎是目前很常见的一类疾病，是一类重大的公共卫生问题，造成很大的社会经济负担[1-2]。鼻窦炎是鼻窦区的异质性组织异常持续发炎的病理状态[3]。最近研究发现miRNA可以与下游相关蛋白的特异性靶标的3′非翻译区中的互补结合，通过调控翻译过程进而抑制或降解相关蛋白以调节靶基因表达模式[4-5]。本研究选择不同类型的鼻窦炎患者， 分别检测其miR-125b mRNA、miR-125b、IFN-β的表达以及真核起始因子4E(eIF-4E)结合蛋白1(4E-BP1)，旨在探讨miR-125b在嗜酸性粒细胞慢性鼻窦炎中的表达模式及生物学作用。
1 资料与方法
1.1 组织样本和材料 选择2016年1月—2017年1月收治的慢性鼻-鼻窦炎不伴鼻息肉(eosinophil-chronic rhinosinusitis without nasal polyps,Eos-CRSsNP)患者40例，男性30例，女性10例，年龄43～64岁，平均(51.1±6.2)岁。选择嗜酸性粒细胞伴有鼻息肉的慢性鼻-鼻窦炎(eosinophil-chronic rhinosinusitis with nasal polyps，Eos-CRSwNP)患者45例，男性25例，女性20例，年龄39～62岁，平均(49.6±4.3)岁。选择非嗜酸性慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉(non eosinophil-chronic rhinosinusitis with nasal polyps,Non-Eos-CRSwNP)患者20例，男性10例，女性10例，年龄39～63岁，平均(51.3±7.1)岁。将因解剖变异而没有任何其他炎性鼻病(如过敏性鼻炎或鼻窦炎)进行鼻中隔矫形术的患者50例列为对照组，男性35例，女性15例，年龄38～58岁，平均(48.5±4.9)岁。4组性别、年龄差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。
刮取各组患者鼻道黏膜上皮细胞作为试验材料，当组织嗜酸性粒细胞百分比超过总浸润细胞的10%时，CRSwNP被分类为嗜酸性粒细胞。
本研究获得医院伦理委员会批准；所有受试患者均签署知情同意书。
1.2 定量实时PCR分析 将细胞接种在12孔板中，生长至50%融合以进行siRNA转染，90%用于质粒转染。根据制造商的方案，使用Lipofectamine 2000转染质粒和siRNA。在转染后第3天，收获细胞，并使用TRIZOL试剂提取总RNA。使用ImProm-Ⅱ TM逆转录系统对总RNA水平进行qPCR分析。所有反应用Step-One Plus实时PCR系统进行，实验重复3次。
1.3 原位杂交 通过使用基于锁核酸的探针(Exiqon)试剂盒在鼻窦黏膜标本的石蜡包埋切片上进行miR-125b的原位杂交分析。在缓冲液A(0.1 mol/L Tris-HC1，0.15 mol/L NaC1，pH 7.5)中平衡5 min，在玻片上滴加碱性磷酸酶的抗地高辛抗体(1∶500～1∶2 000稀释于含0.5% 阻断液的缓冲液A中)，室温反应2 h。用缓冲液A洗2次，每次15 min。在缓冲液B(0.1 mmol/L Tris-HCl，0.1 mol/L NaCl，0.05 mol/L MgCl2，pH 9.5)中平衡5 min。将硝基四氮唑蓝(nitrotetrazolium Blue chloride，NBT)和吲哚氧磷酸盐(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate,BCIP)溶于缓冲液B中，每1 mL缓冲液B含有4.5 μL NBT和3.5 μL BCIP。在玻片上滴加混合染液在湿盒中显色过夜。充分显色后，用EDTA(1 mmol/L EDTA，pH 8.0)洗15 min终止反应。在95%乙醇中洗1 h以除去非特异的背景。用蒸馏水洗15 min除去可能存在的结晶体。脱水、透明，用中性树胶封片。充分干燥后在显微镜下观察、照相。
1.4 免疫组织化学 采用链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物方法进行免疫组织化学染色，检测IFN-β蛋白质的表达。使用二氨基联苯胺进行显色，阳性细胞呈棕色。应用HPIAS-1000自动图像分析系统分析IFN-β蛋白表达的定量测量，计数每毫米组织中的阳性细胞数目。
1.5 统计学方法 应用SPSS 22.0软件处理数据。计量资料比较分别采用单因素方差分析和SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 各组miR-125b mRNA、miR-125b和IFN-β表达比较 Eos-CRSsNP组、Eos-CRSwNP组和Non-Eos-CRSwNP组miR-125b mRNA表达均高于对照组，Eos-CRSwNP组高于Eos-CRSsNP组和Non-Eos-CRSwNP组(P<0.05)；Eos-CRSsNP组、Eos-CRSwNP组和Non-Eos-CRSwNP组miR-125b表达均高于对照组(P<0.05)；Eos-CRSsNP组、Eos-CRSwNP组和Non-Eos-CRSwNP组IFN-β表达均高于对照组，Eos-CRSwNP组高于Eos-CRSsNP组和Non-Eos-CRSwNP组(P<0.05)。见表1,图1，2。
表1 各组miR-125 bmRNA、miR-125b和IFN-β表达比较 
组别例数miR-125b mRNA表达 miR-125b表达IFN-β表达Eos-CRSsNP组40 3.56±0.63∗#△1.45±0.44∗ 1.36±0.51∗#△Eos-CRSwNP组453.92±0.75∗#1.52±0.41∗2.12±0.72∗#Non-Eos-CRSwNP组202.51±0.71∗1.38±0.26∗1.97±0.49∗对照组502.02±0.611.12±0.251.10±0.42F值76.41211.37442.507P值0.0000.0000.000
*P值<0.05与对照组比较 #P值<0.05与Non-Eos-CRSwNP组比较 △P值<0.05与Eos-CRSwNP组比较(SNK-q检验)
图1 原位杂交试验检测miR-125b在鼻窦炎组织中的表达
图2 免疫组织化学染色检测miR-125b对IFN-β表达的影响
2.2 miR-125b和4E-BP1之间的调控关系 与对照组相比较，抑制miR-125b表达后，4E-BP1蛋白表达水平相应上调[(3.79±1.23)vs(2.00±0.00)，t=11.680，P<0.05]，增加miR-125b的表达后，4E-BP1蛋白的表达水平相应下调[(1.15±0.46)vs(2.00±0.00)，t=13.650，P<0.05]，见图3。
图3 Western blotting检测miR-125b对4E-BP1蛋白表达水平的影响
3 讨 论
在过去20年中，越来越多的研究证据表明，慢性鼻窦炎是一种异质性的窦性疾病，涉及很多免疫因子的参与[6]。最近对国内慢性鼻窦炎的研究表明，混合型的Th1/Th2/Th17反应在慢性鼻窦炎中广泛存在。然而，Eos-CRSsNP是Th1因子作用的主要环境，而Th2因子的炎症作用在嗜酸性粒细胞的CRSwNP中广泛存在[7-8]。因此，本研究集中探讨miRNA在嗜酸性粒细胞慢性鼻窦炎中的表达模式及相关作用，旨在为嗜酸性粒细胞鼻窦炎的诊断和治疗提供一定的理论参考。
在慢性鼻窦炎中存在miRNA的表达失调，表明在不同亚型慢性鼻窦炎中存在不同致病机制的假说[9]。以往的阵列测定发现在Eos-CRSsNP和嗜酸粒细胞CRSwNP中具有不同表达模式的4种差异miRNA表达(miR-26a、miR-125b、let-7a和miR-155)，然后通过进一步筛选出miR-125b在嗜酸性粒细胞存在异常明显的表达差异，且miR-125b是通过微阵列测定发现的嗜酸性粒细胞CRSwNP中唯一上调的miRNA。为了进一步探讨miRNAs在嗜酸粒细胞CRSwNP发病机制中的作用，通过在mRNA表达水平和原位杂交试验检测发现，与对照组和其他类型的慢性鼻窦炎相比，嗜酸性粒细胞CRSwNP中miR-125b的特异性上调明显。这与miR-125b在其他炎症性疾病中的表达相似，在从大组受试者的完全分离的样品组中通过定量PCR检测发现miR-125b在包括气管在内的多种器官炎症组织中存在表达上调现象[10]。本研究原位杂交染色表明miR-125b主要在鼻窦黏膜上皮细胞表达。有研究证实，在原发性鼻黏膜和炎性支气管上皮细胞中miR-125b表达明显高于正常气道上皮细胞中的miR-125b表达[11]。此外，本研究结果显示嗜酸性CRSwNP中上皮细胞miR-125b的表达显显著增加。以上结果间接证实了miR-125b与嗜酸粒细胞CRSwNP之间存在一定的关联。
有研究表明miR-125b与下游相关蛋白结合后可参与细胞行为学调控，推测miR-125b受Toll样受体激活后可通过下调4E-BP1的表达促进气道上皮细胞诱导Ⅰ型IFN-β分子的产生[12]。Kim等[13]研究表明，在嗜酸细胞CRSwNP中4E-BP1蛋白表达降低，而IFN-β和IFN调节因子7蛋白表达增加。IFN-β的mRNA表达水平与鼻窦黏膜中嗜酸性粒细胞浸润程度呈正相关[14]。最近的一项研究显示，IFN-β可以诱导气道上皮细胞中肿瘤坏死因子家族产生的B细胞激活因子产生，这与CRSwNP中的局部嗜酸性粒细胞增多有关[15]。另外，Kim等[16]研究指出miR-125b可以靶向肿瘤坏死因子α转录物的3′非翻译区，并且是P53基因的负调节因子。4E-BP1转录物的3′非翻译区含有进化上相对保守的miR-125b结合位点[17]。为了进一步了解探讨miR-125b的功能，本研究通过Western blotting检测确定4E-BP1蛋白是miR-125b的下游分子靶标，过表达miR-125b可以相应下调4E-BP1蛋白表达水平，同样抑制miR-125b表达可以上调4E-BP1蛋白表达。上述结果表明miR-125b可以直接参与调控4E-BP1 mRNA翻译过程。而Lee等[18]通过双荧光素酶实验研究分析表明，4E-BP1转录物的3′非翻译和miR-125b结合位点突变后相应作用消失，表明miR-125b可以直接介导4E-BP1抑制，表明miR-125b和4E-BP1 mRNA具有相互作用的特异性。总之，上述相关发现表明4E-BP1是miR-125b的直接靶标，且4E-BP1蛋白表达与miR-125b表达呈负相关。
miR-125的表达调控方式是未知的，本研究推测细菌和病毒感染和促炎症因子Th1、Th2和Th17细胞因子均参与慢性鼻窦炎的发病机制，且通过促进Ⅰ型IFN-β表达、miR-125b调控途径可能有助于嗜酸性粒细胞CRSwNP中的黏膜细胞数量的增多，进而调控相应炎症过程的发展。
综上所述，本研究分层探讨了不同类型的鼻窦炎组织中miR-125b的表达模式，明确了 miR-125b介导4E-BP1蛋白的表达在鼻窦炎抗病毒先天免疫中起关键作用，且可以影响IFN-β的表达参与嗜酸性粒细胞性鼻窦炎的进展过程，为嗜酸性粒细胞性鼻窦炎的诊断和治疗提供一定的参考意见。
[1] Fokkens W,Lund V,Mullol J，et al. European position paper on rhinosinusitis and nasal polyps 2007[J]. Rhinol Suppl,2007,20:1-136.
[2] Bachert C,Mannent L,Naclerio RM,et al. Effect of subcutaneous dupilumab on nasal polyp burden in patients with chronic sinusitis and nasal polyposis:a randomized clinical trial[J]. JAMA,2016,315(5):469-479.
[3] Xu M,Chen D,Zhou H,et al. The role of periostin in the occurrence and progression of eosinophilic chronic sinusitis with nasal polyps[J]. Sci Rep,2017,7(1):9479.
[4] Castro M,Mathur S,Hargreave F,et al. Reslizumab for poorly controlled,eosinophilic asthma:a randomized,placebo-controlled study[J]. Am J Respir Crit Care Med,2011,184(10):1125-1132.
[5] 李芳梅,郑家法.miRNA 在慢性鼻-鼻窦炎中的应用进展[J]. 临床耳鼻咽喉头颈外科杂志,2016,30(20):1656-1658.
[6] ten Brinke A,Grootendorst DC,Schmidt JT,et al. Chronic sinusitis in severe asthma is related to sputum eosinophilia[J]. J Allergy Clin Immunol,2002,109(4):621-626.
[7] 顾兆伟,曹志伟,王韫秀.TLR2 和 TLR4 在慢性鼻窦炎鼻息肉中的表达及临床意义[J].中国耳鼻咽喉颅底外科杂志,2013,19(1):43-47.
[8] Brook I. Bacteriology of chronic maxillary sinusitis in adults[J]. Ann Otol Rhinol Laryngol,1989,98(6):426-428.
[9] Nohata N,Hanazawa T,Kikkawa N,et al. Tumour suppressive microRNA-874 regulates novel cancer networks in maxillary sinus squamous cell carcinoma[J]. Br J Cancer,2011,105(6):833-841.
[10] Soyka MB,Wawrzyniak P,Eiwegger T,et al. Defective epithelial barrier in chronic rhinosinusitis:the regulation of tight junctions by IFN-γ and IL-4[J]. J Allergy Clin Immunol,2012,130(5):1087-1096，e10.
[11] Tanaka H,Hazama S,Iida M,et al. miR-125b-1 and miR-378a are predictive biomarkers for the efficacy of vaccine treatment against colorectal cancer[J]. Cancer Sci,2017,108(11):2229-2238.
[12] Djukanoviç R,Harrison T,Johnston SL,et al. The effect of inhaled IFN-β on worsening of asthma symptoms caused by viral infections. A randomized trial[J]. Am J Respir Crit Care Med,2014,190(2):145-154.
[13] Kim JH,Kim YS,Cho GS,et al. Human rhinovirus-induced proinflammatory cytokine and interferon-β responses in nasal epithelial cells from chronic rhinosinusitis patients[J]. Allergy Asthma Immunol Res,2015,7(5):489-496.
[14] Hatchwell L,Collison A,Girkin J,et al. Toll-like receptor 7 governs interferon and inflammatory responses to rhinovirus and is suppressed by IL-5-induced lung eosinophilia[J]. Thorax,2015,70(9):854-861.
[15] Huizinga R,van Rijs W,Bajramovic JJ,et al. Sialylation of Campylobacter jejuni endotoxin promotes dendritic cell-mediated B cell responses through CD14-dependent production of IFN-β and TNF-α[J]. J Immunol,2013,191(11):5636-5645.
[16] Kim JK,Jang SW,Suk K,et al. Fascin regulates TLR4/PKC-mediated translational activation through miR-155 and miR-125b,which targets the 3′ untranslated region of TNF-α mRNA[J]. Immunol Invest,2015,44(3):309-320.
[17] Riquelme I,Tapia O,Leal P,et al. miR-101-2,miR-125b-2 and miR-451a act as potential tumor suppressors in gastric cancer through regulation of the PI3K/AKT/mTOR pathway[J]. Cell Oncol(Dordr),2016,39(1):23-33.
[18] Lee M,Kim EJ,Jeon MJ. MicroRNAs 125a and 125b inhibit ovarian cancer cells through post-transcriptional inactivation of EIF4EBP1[J]. Oncotarget,2016,7(8):8726-8742.