神经干细胞(neural stem cells，NSCs)[1-7]具有自我分裂、增殖更新，以及分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的特性。NSCs的发现，更新了神经元不能再生的观点，对于深入了解神经系统的结构和功能至关重要[8-10]。如果NSCs能够大量获得，并达到进行自体或异体移植，成功治疗某些神经系统疾病的目的，将会推动医学的重大进步。NSCs在成年鼠和胚胎脑中均有分布，但是胚胎脑中的比例远高于成年脑。目前，NSCs体外培养有一定难度，增殖率低，不易大量获得。对此，本研究在实验中摸索出一种高效的NSCs培养方法，培养的NSCs纯度高、增殖快，且具有多向分化潜能，值得推广应用。
1 材料与方法
1.1 实验动物和试剂 ICR孕鼠(孕12.5 d)，由河北省实验动物中心提供。DMEM/F12培养基，Gibco公司，美国；胎牛血清，Hyclone公司；L-谷氨酰胺，Invitrogen公司；牛血清白蛋白，Sigma，美国；青霉素、链霉素，Hyclone公司；Accutase, Sigma公司，美国; 多聚赖氨酸(Poly-L-lysine,PLL), Sigma，美国；Cell Counting Kit-8(CCK8)，日本同仁化学研究所; 碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)，Peprotech公司; 表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)，Peprotech公司； Tween-20，Sigma，美国； N2添加剂， Invitrogen公司；B27添加剂，Hyclone公司；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)，Sigma，美国；Triton X-100，Sigma，美国；过氧化氢，天津化学试剂三厂；巢蛋白(nestin)单克隆抗体，NSE多抗，GFAP多抗，Santa Cruz公司，美国；DyLightTM594标记山羊抗兔IgG，北京中杉金桥。
1.2 分离培养 取孕12.5 d ICR孕鼠，用戊巴比妥腹膜下注射麻醉(65 mg/kg)，孕鼠腹部以75%酒精消毒后，手术剪打开腹腔，剪开子宫，将胎鼠用75%酒精消毒后断头处死，用眼科手术剪剪开全脑，置于D-HANKs液的培养皿中。在解剖显微镜下充分去除软脑膜和脉络丛组织。去除胎鼠颜面部后逐层分离，取出皮质剪成约1 mm3大小，移入无菌10 mL离心管。用3倍体积的Acutase消化，37 ℃水浴5 min。用由粗到细的火焰抛光的玻璃吸管轻轻吹打成单细胞悬液(此步骤时间不超过3 min)。垂直静置15～30 min，使未吹开的大块组织沉底。将上清移入另一无菌10 mL离心管，加无菌PBS，吹打均匀，1 000 r/min，5 min，离心洗涤2～3次，至上清清澈。应用新的培养基，主要成分为B27、20 ng/mL bFGF和20 ng/mL EGF 的DMEM/F12，将细胞重悬于该培养基中，以5×105个细胞/mL密度接种在75 mL的玻璃培养瓶中。置37 ℃，5%CO2 饱和湿度培养箱内进行培养。2～3 d换液1次。每天倒置显微镜进行观察。
1.3 传代培养 细胞在接种后3～4 d神经球形成后，进行传代，以5×105个细胞/mL继续培养。传代过程：待神经球形成后，准备10 mL无菌离心管，并将细胞移入管中；神经球垂直静置管中15～30 min后沉底；将上清吸走，向沉淀中加入3 倍体积的Acutase消化液，进行37 ℃水浴5 min；再用细火焰抛光的玻璃吸管轻轻吹打成单细胞悬液(此步骤时间不超过5 min)；记数后以5×105个细胞/mL继续培养，培养基成分同上。
1.4 小鼠NSCs鉴定
1.4.1 nestin 免疫荧光 将培养的神经球离心，1 000 r/min，5 min，PBS洗涤3遍后，加入4%多聚甲醛固定，4 ℃，30 min。PBS洗3遍后加入终浓度0.01%的结晶紫染色5 min。PBS洗2遍后将球加入盛有OCT包埋剂的EP管。将EP管于液氮中冷冻30 s，放入冰冻切片机平衡20 min后进行冰冻切片，片厚10 μm。将切片用烤片机烤干，-20 ℃保存；取出切片，PBS浸泡10 min；用含0.3%Triton X-100的PBS透膜10 min，用0.01 mol/L PBS洗涤3次，5 min/次；再用含10% BSA和2%马血清的封闭液于37 ℃孵育30 min后加入2% BSA稀释的特异性一抗[兔抗nestin单克隆抗体(1∶100)]，湿盒中4 ℃孵育过夜。用含0.1% Tween 20的PBS洗涤3次，5 min/次，加入2% BSA稀释的二抗(DyLightTM594标记山羊抗兔IgG含有4,6-联脒-2-苯基吲哚)，湿盒中避光室温孵育1 h。用含0.1% Tween 20的PBS洗涤3次，5 min/次，0.01 mol/L PBS洗涤1次，5 min。避光封片[封片剂：8.5 mL甘油+1 mL对苯二胺(10 g/L)，用碳酸盐缓冲液调pH至8.5～8.8]。最后荧光显微镜下观察结果，采集图像。
1.4.2 生长曲线绘制(CCK8法) 向96孔板中每孔加入100 μL细胞悬液，含1 000个细胞，在37 ℃下预孵育培养板。从第2天开始，每天任意取5孔，加入10 μL CCK8溶液，37 ℃下孵育2 h；在酶标仪上测定光吸收值，测定波长为450 nm。用所测得的CCK8值绘制生长曲线。
1.4.3 分化潜能 收集神经球接种于PLL包被的盖玻片上，加入条件培养液。条件培养液组成：含B27和N2的DMEM/F12 培养基中，加入10 ng/mL胶质细胞源性神经营养因子。在培养后3 d各取出3片细胞进行胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(neuronal specific enolase，NSE)免疫细胞化学染色检测。
取出细胞爬片，用0.01 mol/L PBS进行3次清洗，5 min/次。4%多聚甲醛固定，室温，30 min。0.01 mol/L PBS清洗3次，5 min/次。 封闭内源性过氧化物酶：3%H2O2 甲醇，室温，10～15 min。0.01 mol/L PBS 清洗3次，每次5 min。暴露抗原：0.3%Triton X-100，室温 10 min。0.01 mol/L PBS 清洗3次，每次5 min。 封闭非特异抗原：滴加10%正常山羊血清，室温或37 ℃，20～30 min。甩去多余的血清，不洗。 一抗孵育：滴加适当稀释的一抗(兔抗NSE一抗(1∶80)、兔抗GFAP一抗(1∶80)，湿盒中，4 ℃，过夜。以不加PBS 代替一抗作阴性对照。0.01 mol/L PBS 清洗3次，每次5 min。二抗孵育：滴加生物素化羊抗兔IgG，37 ℃，1 h。0.01 mol/L PBS 清洗3次，每次5 min。三抗孵育：滴加SABC，37 ℃，1 h。0.01 mol/L PBS 清洗3次，每次5 min。显色：用DAB显色液显色，显微镜下监测，终止。0.01 mol/L PBS 清洗3次，每次5 min。常规脱水、透明、封片。显微镜下观察结果，采集图像。
2 结 果
2.1 形态学观察 细胞原代培养结果显示，在接种后1 d，细胞多呈悬浮生长状态，以单细胞形式多见。接种后2 d，悬浮的单细胞逐渐减少，而细胞团开始增多，并疏松连接在一起。接种后3～4 d，细胞团继续增多，并且体积增大，以规则圆形分散悬浮，细胞连接逐渐紧密。细胞团即为NSCs增生形成的神经球，其外围分布有一层大小较均匀，折光性好的细胞(图1)。
图1 倒置显微镜观察的神经球( ×200)
Figure 1 Neurospheres observed by inverted microscope( ×200)
2.2 小鼠NSCs的鉴定
2.2.1 nestin免疫组织化学染色 结果显示，神经球内大部分细胞呈nestin阳性，阳性反应产物主要聚集在细胞浆内(图2)。
2.2.2 细胞生长曲线 细胞在传代后4 d内以增殖为主；以5×105个细胞/mL进行传代，测得CCK8值为0.117，细胞倍增时间为2 d；4 d时CCK8值达0.331，此时细胞密度最高，是传代细胞数的2.83倍；自5 d后，细胞增殖减慢，CCK8值逐渐下降(图3)。
2.2.3 细胞的分化潜能 经诱导分化后，神经球周围细胞逐渐爬出，呈贴壁生长，细胞体积增大，并伸出放射状的细长突起；随着细胞向周围迁移，细胞形态从圆形转变为多角形或椎体形，有突起相互交织，具有神经元样的形态特征。细胞密度由神经球中心向周缘逐渐下降。
免疫细胞化学染色显示：先爬出的细胞为GFAP阳性，其伸出的细长辐射状突起交织成丛(图4)，形成支架，可引导其他细胞向周围迁移；后伸出的细胞为NSE阳性细胞，附着于支架上，从神经球的中心向周围呈分散状分布，其胞体呈三角形或椎体形，突起相对细小，也相互交织成丛(图5)，体积较大、突起明显的NSE阳性细胞着色较深，体积较小、突起少的NSE阳性细胞着色较浅。
图2 免疫细胞化学检测神经球中巢蛋白和Ki67阳性细胞，DAPI染色细胞核( ×200)
Figure 2 Nestin and ki67 positive cells in neurospheres were detected by immunocytochemistry, with dapi stained the nuclei( ×200)
图3 小鼠神经干细胞的生长曲线
Figure 3 The growth curve of mouse NSCs
图4 诱导分化后的GFAP阳性细胞( ×200)
Figure 4 GFAP positive cells after neurospheres were induced to differentiation( ×200)
图5 诱导分化后的NSE阳性细胞( ×200)
Figure 5 NSE positive cells after neurospheres were induced to differentiation( ×200)
3 讨 论
NSCs的发现，对于了解神经系统的发生、发育规律、调控机制以及在神经系统疾病和损伤治疗中有了广阔的应用前景。NSCs培养以无血清培养技术[11]为主，目的是去除诱导NSCs分化的成分，同时添加bFGF和(或)EGF，能够促进NSCs的有丝分裂，抑制NSCs分化。这种培养技术也有不足，因为是悬浮培养，所以当神经球逐渐增大到一定程度时，在中心区的细胞出现营养缺乏，导致细胞的凋亡或坏死。本研究结果与上述报道一致，反映细胞增殖状态的Ki67免疫阳性细胞主要位于神经球边缘与培养基充分接触的部位，而神经球内部较少见。
本研究观察到，将NSCs消化为单细胞，接种于用Matrigel铺过底的培养皿中，细胞分散均匀，贴壁迅速，分化同步。在诱导分化后1 d即可呈现出2种细胞类型：一种细胞伸出长而粗的突起，且突起交织成网，构成支架，具备胶质细胞的特征；另一种细胞突起较少，形态多为圆形，推测为正在分化的细胞；也可见具备典型神经元形态的细胞。诱导分化后2 d，具有神经元形态特征的细胞突起进一步生长，交织；胶质细胞突起变得不明显，数量下降，有细胞死亡。诱导后3 d，部分细胞死亡，死亡细胞以胶质细胞为主；具有神经元形态特征的细胞仍可见较长的突起，基本形态仍存在。
NSCs在成年和胚胎脑中都有分布，胚胎脑中的比例远高于成年脑。有报道，NSCs培养中，分离单细胞的方法有酶消化法和机械分离法2种。在神经球传代时，用传统的胰酶消化，不易掌握消化时间，容易造成消化过度或消化效果欠佳。因此，推荐机械分离法，对传代神经球进行切割，但该方法耗时长，并且容易污染。本研究在传代培养时，用Sigma公司推出的专用酶Acutase消化液对神经球进行消化，可将其消化成单细胞，在不损伤细胞膜的前提下，可达到较理想的分离效果。
NSCs具有增殖更新能力和多向分化潜能，巢蛋白为其特征性标记[12-14]。巢蛋白的表达是暂时性的，一旦前体细胞分化成终末分化细胞如神经元或胶质细胞，巢蛋白的表达即终止[15]。本研究所培养的细胞增殖活跃(细胞倍增时间为2 d)，经免疫细胞化学染色证实，所培养细胞为nestin阳性细胞，并且可以分化为星形胶质细胞(GFAP是星形胶质细胞特异性标记物，常用作标记星形胶质细胞[16-17])和神经元(NSE阳性细胞[18-19])。因此，可以确定培养的细胞即为NSCs。
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