胃癌是我国最常见的消化系统恶性肿瘤，是一个多阶段、多步骤、多因素的疾病[1-2]。探明胃癌细胞发生的重要调节因子能够为胃癌治疗提供新的靶点。microRNA是一类非编码小分子RNA，在转录水平或者翻译水平调节下游靶基因表达水平[3]。已有文献报道多种microRNA参与胃癌的发生与发展，如miR-5590-3p[4]、miR-124-3p[5]、miR-23a/27a[6]和miR-155-5p[7]。miR-19a-3p属于miR-17-92家族，具有重要的生物学功能[8]。miR-19a-3p与多种癌症的发生相关[9-11]。本研究探讨miR-19a-3p与人胃癌细胞增殖的关系，旨在为人胃癌的防治提供新的思路，报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选择2016年2月—2017年9月河北省邢台市第一医院收治的人胃癌病理标本20例，男性12例，女性8例；年龄30～60岁，其中年龄<50岁12例，≥50岁8例。以肿瘤中心的癌组织作为胃癌组织标本；距胃癌组织3 cm的组织标本作为癌旁组织标本；取胃癌组远离癌灶近侧或远侧断端胃黏膜，所有断端均距离癌灶超过5 cm，并经病理染色证实为正常胃黏膜，作为正常胃黏膜组织标本。
1.2 材料与试剂 人胃癌MKN28细胞系购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。H-DMEM培养基(Gibico公司)、胎牛血清(Hyclone公司)、PTEN抗体和GAPDH抗体(Cell signaling Technology公司)、HRP标记的山羊抗兔二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)、化学发光试剂盒(millipore公司)、MTT(北京索莱宝生物技术有限公司)。miR-19a-3p mimics、miR-19a-3p inhibitor及其阴性对照片段、PTEN特异的siRNA及其阴性对照片段均购于上海吉玛生物技术有限公司。RNA提取试剂Trizol(Invitrogen公司)、SYBR Green(TaKaRa公司)；反转录和PCR引物均由上海生物工程有限公司合成。
1.3 人胃癌细胞株MKN28细胞培养 人胃癌MKN28细胞培养于含10%胎牛血清H-DMEM培养基，孵育于37 ℃、含5% CO2的培养箱(Thermo公司)。每2 d更换培养基1次，待细胞密度达70%～80%时，使用0.25%胰蛋白酶消化3 min，培养基中和后800 r/min室温离心8 min，弃上清重悬后按照1∶5进行传代。
1.4 miR-19a-3p 类似物、miR-19a-3p 反义链及siRNA-PTEN细胞转染 转染前1 d将MKN28细胞种于6孔板中，待细胞80%融合后，用PBS洗6孔板中的细胞1次，每孔加入1.6 mL完全培养基(含 10%牛血清和双抗的H-DEME培养液)。按照说明将siRNA稀释成为20 μmol/L工作液。按转染试剂试剂盒说明书，在1.5 mL EP管中加入如下体系：3.75μL siRNA(20 μmol/L)，116.25 μL EC buffer,8 μL Enhancer振荡1 s后室温放置3 min，然后加入10 μL Effectene，混匀后室温放置10 min，同时，以上1.5 mL EP管分别加入462 μL完全培养基，混匀后加入6孔板中，置于37 ℃、含5% CO2的培养箱中培养48 h，收集细胞进行检测。miR-19a-3p 类似物、miR-19a-3p 反义链及siRNA-PTEN均购买于上海吉玛生物技术公司。miR-19a-3p类似物序列：5′-UGUGCAAAUCUAUGCAAA-CUGA-3′；阴性对照：5′-UUCUCCGAACGUGU-CACGU-3′。miR-19a-3p反义链序列：5′-UCAGUUUUGCAUAGAUUUGCACA-3′;反义链阴性对照：5′-CAGUACUUUUGUGUAGUAC-AA-3′。siRNA-PTEN序列：5′-AGACUUGAAG-GCGUAUACA-3′。
1.5 实时荧光定量RT-PCR检测miR-19a-3p水平 MKN28细胞转染后48 h，使用Trizol试剂提取细胞总RNA。20 μL DEPC水稀释后测RNA浓度。取2 μg RNA进行逆转录合成测cDNA。反应体系如下：2 μL RNA(1 g/L)，1 μL dNTP Mix(10 mmol/L)，1 μL Oligo(dT)18 Primer(0.5 g/L)， 1 μL DEPC水，加入PCR管中并瞬时离心混匀，放入PCR仪中70 ℃预变性10 min，骤冷至4 ℃。再加入1 μL 1×Rection Buffer，1 μL RNAse inhibtior,1 μL M-MuLV transcriptase,2 μL DEPC H2O，加入PCR管中并瞬时离心混匀，放入PCR仪中42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min，反转录成cDNA。
cDNA稀释10倍后取2 μL稀释液，用SYBR Green试剂盒进行PCR。反应条件为：上下游引物各0.4 μL，5 μL SYBR Green Mix，2 μL 模板cDNA，2.2 μL ddH2O加入PCR管中并瞬时离心混匀，放入PCR仪中95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min(收集荧光)，40个循环。以gapdh为内参照，计算目的基因mRNA表达量。采用△Ct法处理结果，计算相对表达量，即2-△△Ct。所有数据处理时以对照组的平均数进行标准化，以求得相对表达水平。反转录引物如下：miR-19a-3p,GTCGTATCC-AGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGAT-ACGACTCAGTT;U6,GTCGTATCCAGT GCA-GGGTCCGA GTA TTC GCACTGGATACGACA AAAATATG。PCR引物如下：miR-19a-3p forward,GCGTGTGCAAATCTATGCAA;U6 forward,GCGCGTCGTGAAGCGTTC;universal reverse primer,GTGCAGGGTCCGAGGT；PTEN forward,CATTTCCATCCTGCAG AAGAAG;PTEN reverse,CCCAATACAGATTCACTTCCT-TTAG；18 s forward，GGAAGGGCACCACCAGG-AGT；18 s reverse，TGCAGCCCCG GACATCT-AAG。
1.6 Western blot检测蛋白表达 MKN28细胞转染后48 h，吸弃培养液，用2 mL预冷PBS洗涤细胞2次；加入200 μL细胞蛋白裂解液 RIPA，用细胞刮刀将细胞刮下，将细胞裂解液收集于1.5 mL EP管中，超声破碎细胞膜结构，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，将上清液转移至新的1.5 mL EP管中，使用BCA试剂盒测量蛋白浓度。取30 μg 蛋白进行SDS-PAGE电泳，300 mA恒定电流转印至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，1∶1 000稀释PTEN和GAPDH抗体4 ℃孵育过夜，TBS-T洗膜3次，每次10 min；使用1∶5 000稀释HRP标记山羊抗兔二抗室温孵育2 h，TBS-T洗膜3次，每次10 min；使用化学发光试剂盒显影。应用Image J软件打开相应显影结果，分析蛋白条带灰度值，以内参为基准计算各组蛋白的相对比值，计算各组蛋白的相对表达量。
1.7 MTT实验 MKN28细胞转染后48 h，离心收集细胞，细胞计数并调整细胞浓度为5×104个细胞/mL，接种于96孔平底培养板中，每孔1×104个细胞，设置3个复孔；在37 ℃、5% CO2培养箱中培养4 h，待细胞完全贴壁后，更换新的200 μL RPMI-1640培养基。37 ℃、5% CO2培养箱培养继续培养24 h、48 h和72 h。每孔小心加入20 μL MTT溶液(5 g/L)，避免划到孔底细胞，继续在37 ℃、5% CO2培养箱中培养4 h。终止培养，小心吸取全部上清。每孔加入200 μL DMSO，置于震荡器上振荡10 min，80 r/min，充分溶解结晶物质，使用酶标仪测量OD490 nm吸光值。
1.8 统计学方法 应用SPSS 13.0统计软件分析数据。计量资料比较分别采用两独立样本的t检验、F检验和SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 miR-19a-3p在人胃癌组织中表达 采用实时荧光定量PCR方法检测20例人胃癌组织和癌旁组织中的miR-19a-3p表达水平，结果显示胃癌组织中miR-19a-3p表达水平明显高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。
Table 1 Comparison of the expression of miR-19 a-3 p between adjacent normal tissues and gastric cancer tissues
组别miR-19a-3p相对表达水平癌旁组织1.000±0.099胃癌组织2.349±0.069t值11.200P值0.000
2.2 miR-19a-3p调节人胃癌MKN28细胞增殖 为了验证miR-19a-3p对人胃癌MKN28细胞增殖的调节作用，通过转染miR-19a-3p 类似物或miR-19a-3p 反义链在MKN28细胞中过表达或者低表达miR-19a-3p，结果显示转染miR-19a-3p 类似物组MKN28细胞中miR-19a-3p水平和细胞增殖水平均明显高于阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；转染miR-19a-3p 反义链组MKN28细胞中miR-19a-3p水平和细胞增殖水平均明显低于反义阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2，3。
Table 3 Comparison of the expression of miR-19 a-3 p and cell proliferation of miR-19 a-3 p between negative control group and miR-19 a-3 p mimic group
组别 相对表达水平细胞增殖水平0 h24 h48 h72 h阴性对照 1.000±0.1110.269±0.0210.350±0.0200.456±0.0090.539±0.012miR-19a-3p类似物3.009±0.4220.275±0.0240.431±0.0160.550±0.0120.731±0.023t值 4.6050.1844.5826.3457.400P值 0.0440.8620.01020.0010.002
Table 3 Comparison of the expression of miR-19 a-3 p and cell proliferation of miR-19 a-3 p between negative control group and miR-19 a-3 p inhibiton group
组别 相对表达水平细胞增殖水平0 h24 h48 h72 h反义阴性对照 1.000±0.0950.234±0.0220.362±0.0260.431±0.0220.580±0.025miR-19a-3p反义链0.366±0.1040.233±0.0210.274±0.0180.327±0.0110.408±0.007t值 4.5010.0412.7524.2386.690P值 0.0210.9690.0400.0130.007
2.3 miR-19a-3p调节PTEN表达水平 转染miR-19a-3p mimic能降低PTEN蛋白水平，但转染miR-19a-3p mimic类似物组与阴性对照组PTEN mRNA水平差异无统计学意义(P>0.05)；转染miR-19a-3p inihibitor能升高PTEN蛋白水平，但转染miR-19a-3p inihibitor反义链组与反义阴性对照组PTEN mRNA水平差异无统计学意义(P>0.05)。见图1，2，表4，5。
图1 阴性对照组与miR-19a-3p类似物组PTEN蛋白水平比较
NC.阴性对照组；19a mimc.miR-19a-3p类似物组
Figure 1 Comparison of PTEN protein levels between negative control group and miR-19a-3p mimic group
图2 反义阴性对照组与miR-19a-3p反义链组PTEN蛋白水平比较
NCI.反义阴性对照组；19a inhibitor.miR-19a-3p反义链组
Figure 2 Comparison of PTEN protein levels between negative control inhibitor group and miR-19a-3p inhibitor group
Table 4 Comparison of PTEN mRNA levels between negative control group and miR-19 a-3 p mimic group
组别 PTEN mRNA相对表达水平阴性对照 1.000±0.103miR-19a-3p类似物0.894±0.071t值 0.894P值 0.437
Table 5 Comparison of protein level of PTEN mRNA levels between negative control group and miR-19 a-3 p inhibiton group
组别 PTEN mRNA相对表达水平反义阴性对照 1.000±0.163miR-19a-3p反义链1.164±0.065t值 0.932P值 0.420
2.4 miR-19a-3p通过PTEN调节MKN28细胞增殖水平 为了进一步验证miR-19a-3p通过PTEN调节MKN28细胞增殖水平，在MKN28细胞中转染特异性靶向PTEN 的siRNA，结果显示miR-19a-3p反义链组MKN28细胞增殖水平低于反义阴性对照组，PTEN siRNA组MKN28细胞增殖水平高于反义阴性对照组，miR-19a-3p反义链+PTEN siRNAMKN28细胞增殖水平低于PTEN siRNA组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表6。
Table 6 Comparison of cell proliferation of miR-19 a-3 p between different groups
组别 0 h24 h48 h72 h反义阴性对照0.208±0.0050.309±0.0070.485±0.0200.620±0.014miR-19a-3p反义链0.188±0.005∗0.244±0.007∗0.337±0.012∗ 0.447±0.025∗PTEN siRNA0.213±0.007#0.471±0.014∗#0.727±0.013∗#0.995±0.013∗#miR-19a-3p反义链+PTEN siRNA0.196±0.007∗△0.439±0.015∗#△0.684±0.010∗#△0.865±0.017∗#△F值 13.936260.056646.866753.199P值 0.0000.0000.0000.000
*P值<0.05与反义阴性对照组比较 #P值<0.05与miR-19a-3p反义链组比较 △P值<0.05与PTEN siRNA组比较(SNK-q检验)
3 讨 论
胃癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，其5年生存率低。早期胃癌诊断率较低，中晚期胃癌化疗效果差，从而导致胃癌患者病死率居高不下。影响胃癌发生和发展的因素很多，microRNA作为一种重要的基因转录后水平调节分子，也参与调节胃癌的发生和发展。miR-195-5p通过调节ZNF139调节胃癌细胞的多药耐药性[12]。本研究结果显示，人胃癌组织中miR-19a-3p表达高于癌旁组织；在MKN28细胞中过表达miR-19a-3p促进细胞增殖，低表达miR-19a-3p抑制细胞增殖；Western blot实验证明miR-19a-3p能够调节PTEN蛋白水平；在MKN28细胞中沉默PTEN能够逆转miR-19a-3p inhibitor对细胞增殖的抑制作用。
miR-19a-3p属于miR-17-92基因簇，位于人染色体13q31.3，能够编码miR-18a、miR-17-5p、miR-19a-3p、miR-20a-3p、miR-19b-3p和miR-92，具有重要的生物学功能[8]。miR-19a-3p通过调节SOCS1和MXD1促进人胃癌细胞的转移和增殖[13-14]。本研究结果显示miR-19a-3p能够促进人胃癌细胞增殖。另外，miR-19a-3p通过PTEN调节胃癌细胞的上皮间质转化，促进胃癌发展[15]。本研究证实在人胃癌细胞中miR-19a-3能够调节下游靶基因PTEN的蛋白表达。miR-19a-3p通过PTEN影响胃癌细胞增殖水平。PTEN是一个经典的抑癌基因，其基因突变或者表达降低能够引起多种癌症的发生。PTEN能够负调节PI3K/AKT信号通路活性，广泛表达于全身各个组织器官[16]。人PTEN蛋白包含403个氨基酸，其三级结构主要包括2个功能区(磷酸酶功能区和C2功能区)和3个结构域(N端PIP2结合区、C端PEST序列、PDZ结合区)。激活的PI3K/AKT信号通路能够促进细胞增殖，活化的PI3K催化PIP2生成PIP3，使下游AKT磷酸化[17]。PTEN具有磷酸酶功能，能够催化PIP3转化成PIP2，进而负调节PI3K/AKT信号通路活性[18]。PTEN表达减少可增强PI3K/AKT信号通路活性，促进细胞增殖。本研究结果显示，miR-19a-3p通过调节PTEN蛋白水平影响MKN28细胞增殖；沉默PTEN蛋白表达能够促进MKN28细胞增殖，并且逆转miR-19a-3p inhibitor对细胞增殖的抑制作用。证明了miR-19a-3p通过下游靶基因PTEN调节人胃癌MKN28细胞增殖，从miR-19a-3p角度阐明了胃癌细胞增殖的机制，为胃癌防治提供了新的思路。
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