miR-214在口腔鳞癌细胞中的表达及生物学分析

口腔癌每年在世界范围内发病为300 400例，每年造成145 400例患者死亡[1]，且有逐年增长趋势。在头颈癌当中，口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma,OSCC)是最为常见的种类，并且是口腔癌的主要组织学类型，约占90%以上，具有发病率高、侵袭性高、患者预后差等特点[2-3]。尽管多模式治疗取得了相当大的进展，但OSCC患者的总生存率并未显著提高[4]。因此，迫切需要深入了解OSCC的分子致癌机制并寻找新的诊断生物标志物或治疗靶标，以提高患者总体生存率。微小RNA(microRNA,miRNA)是非编码RNA的小片段，许多细胞代谢过程，包括分化、发育、增殖和凋亡，是由miRNA控制的[5]。它通过与靶mRNA的3′-非翻译区中的互补序列结合调节蛋白质编码基因表达[6]，通过影响mRNAs的转录和稳定性在基因表达转录后的调控中发挥作用。迄今已报道超过2 500种人类miRNA，并且预测超过30%的人类基因受这些miRNA的调节。越来越多的证据表明，miRNA在多种人类肿瘤中异常表达，并参与肿瘤发生的关键过程，如细胞增殖、分化、迁移和侵袭[7]，由miRNAs介导的转录后基因调控是一种重要的基因调控方式。研究发现，miRNA的失调与OSCC的进展和预后密切相关[8]。已有实验数据证实miR-214在几种类型的人类恶性肿瘤中失调[9-11]。然而，miR-214在不同类型的癌症中扮演各种角色，甚至可能是相反的角色。目前关于miR-214在口腔癌发生中的生物学功能及其作用的分子机制尚不明确，通过生物学信息预测Ras受体RASSF5基因可能是miR-214作用的靶基因。本研究观察miR-214表达水平对口腔癌细胞系生物学特性及对RASSF5蛋白表达水平的影响，旨在为探明口腔癌发病的分子机制提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 细胞株与试剂人口腔癌细胞株SCC-15和CAL-27来源于中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心；高糖DMEM培养基和RPMI 1640培养基购于GIBCO公司；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购于以色列Biological Industries，Lipofectamine 2000购于美国Invitrogen公司；Trizol购于美国Invitrogen公司，逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购于QIAGEN公司；小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)是由上海吉玛公司设计提供，逆转录PCR(reverse transcrition-polymerase chain reaction，RT-PCR)引物是由上海生工合成；CCK-8细胞增殖-毒性检测试剂盒购于日本DOJINDO公司；Transwell小室(8 μm，24孔)购于美国康宁公司；Metrigel胶购于BD公司；anti-RASSF5 mAb和goat anti mouse-AF488购自Abcam公司。

1.2 细胞培养将SCC-15和CAL-27细胞复苏后，分别接种于对应的完全培养液中，SCC-15使用含10% FBS和1%非必需氨基酸的高糖DMEM培养液；CAL-27细胞使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液。置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，镜检细胞汇合度达到80%以上时胰酶消化传代。

1.3 小干扰RNA 引物设计及转染根据miR-214的基因序列(NC_000001.11)，通过特异性siRNA引物设计网站(http://sidirect2.rnai.jp)设计并筛选出了一条靶向miR-214基因的siRNA(miR-214-siRNA，上游序列 5′-AUGUUCUGCACAGCAAG-UGUA-3′，下游序列5′-CACUUGCUGUGCAGA-ACAUCC-3′)，这部分工作已于课题前期完成。同时设计不针对任何基因的随机序列(siRNA-NC，5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，5′-ACGU-GACACGUUCGGAGAATT-3′)，以上序列均由上海生工生物工程有限公司合成。按照Lipofectamine 2000的操作步骤转染各组细胞株，转染后48 h，用荧光定量PCR方法检测各组中miR-214的干扰效率。

1.4 qRT-PCR 检测miR-214 mRNA水平取对数生长期的SCC-15和CAL-27细胞，用Trizol裂解液抽提细胞总的RNA。使用NanoDrop 2000紫外分光光度计初步判断样品的浓度和质量。经逆转录试剂盒转录成cDNA，使用SYBR Green I染料进行RT-PCR扩增，反应体系为20 μL，反应条件为94 ℃变性30 s，预处理；94 ℃、20 s，58 ℃、20 s，共32个循环扩增，72 ℃、3 min延伸。miR-214在各组细胞中的表达变化倍数通过公式2-△△Ct进行相对定量分析。ΔCt=Ct(待检样品的miR-214)-Ct(内参)，△△Ct值=实验组△Ct值-对照组△Ct值。将2种细胞均分为miR-214-siRNA组和siRNA-NC组，同时每种细胞均设置仅加入转染试剂的空白对照组。

1.5 细胞增殖、迁移和侵袭能力检测实验

1.5.1 WST-8增殖实验将转染后的SCC-15和CAL-27细胞各组接种于96孔培养板，每个时间点对应的实验组设置3个复孔。分别于转染后0，24，48，72 h后在孔中加入WST-8试剂，继续孵育3 h后，检测450 nm波长下各孔的吸光度(A)。计算RNA靶向干扰miRNA-214的相对增殖抑制率[抑制率(%) = (A对照组-A实验组)/A对照组×100%]。每组实验重复3次。

1.5.2 划痕实验在6孔板底部用记号笔等间距画5条横线，消化处于对数生长期的细胞接种于6孔板，每孔接种数量约为 5×105个。细胞达到汇合度70%时进行转染，细胞汇合度超过90%后进行划痕实验。将经灭菌的直尺与孔板底部的横线垂直放置，用200 μL枪头沿着直尺在单层细胞上划痕并保持直立。然后用PBS冲洗3次，尽量将漂浮细胞清洗干净，加入无血清培养液，5%CO2、37 ℃培孵箱培养。于0，24，48，72 h观察划痕愈合情况并拍照。每组设置3个复孔。

1.5.3 Transwell小室考察细胞侵袭能力将转染后的SCC-15和CAL-27各3组细胞接种于经Matrigel胶包被的Transwell上室，在Transwell下室加入RPMI 1640完全培养液(含10%胎牛血清)，24 h和48 h后将上室未穿膜的细胞以及基质胶轻轻擦去，下层侵袭的细胞用2～8 ℃预冷的甲醇固定10 min，晾干后用1%结晶紫染色，400倍放大下随机选择5个有代表性的视野计数。实验设置重复3次。

1.6 免疫组织化学染色考察RASSF5蛋白表达在12孔板中接种2种细胞，每种分为2组，miR-214-siRNA组和siRNA-NC组。生长至50%时弃上清，PBS清洗1次，加冰甲醇固定5 min，然后进行封闭染色，其中RASSF5一抗(1∶500)作用2～8 ℃避光过夜，山羊抗鼠二抗-AF488(1∶2 000)室温孵育2 h。染色结束后比较2组细胞的平均荧光强度。

1.7 统计学方法应用SPSS 18.0统计软件分析数据。计量资料比较分别采用两独立样本的t检验、F检验和SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RNA干扰后SCC-15和CAL-27细胞miR-214水平变化 siRNA-NC组在SCC-15细胞的表达低于空白对照组，miR-214-siRNA组在SCC-15 细胞株的表达水平明显低于空白对照组和siRNA-NC组(P<0.05)；miR-214-siRNA组在CAL-27细胞株中的表达低于空白对照组和siRNA-NC组(P<0.05)，而siRNA-NC组与空白对照组差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2 WST-8检测增殖各组在SCC-15细胞株中培养48 h 和72 h增殖能力高于24 h,培养72 h增殖能力高于48 h(P<0.05)；培养24 h、48 h和72 h 后，siRNA-NC组增殖能力低于空白对照组， miR-214-siRNA组增殖能力低于siRNA-NC组和空白对照组(P<0.05)。各组在CAL-27细胞株中培养48 h 和72 h增殖能力高于24 h,培养72 h增殖能力高于48 h(P<0.05)；培养24 h后， miR-214-siRNA组低于空白对照组(P<0.05)，而与siRNA-NC组差异无统计学意义(P>0.05)，培养 48 h和 72 h后，siRNA-NC组和miR-214-siRNA组增殖能力低于空白对照组， miR-214-siRNA组又低于siRNA-NC组(P<0.05)。见表2。

*P值<0.05与空白对照组比较 #P值<0.05与siRNA-NC组比较 aP值<0.05与24 h比较 bP值<0.05 与48 h比较(SNK-q检验)

2.3 迁移能力变化用划痕实验观察miR-214敲低表达对细胞迁移能力的影响，结果显示miR-214的敲低表达降低了口腔癌细胞株SSC-15和CAL-27的愈合能力，延长了愈合时间，见图1，2。

2.4 侵袭能力变化用Transwell侵袭实验观察miR-214敲低表达对细胞侵袭功能的影响，结果显示SCC15 细胞和CAL-27细胞的miR-214-siRNA组在培养24 h和48 h穿膜细胞数差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3。

2.5 miR-214敲低后RASSF5蛋白表达水平的变化 SCC-15细胞和CAL-27细胞分别转染miR-214-siRNA组和siRNA-NC组，生长至50%终止培养并进行免疫荧光染色。用DAPI染料使细胞核着蓝色，用A-488染料使RASSF5蛋白着绿色。SCC-15细胞转染miR-214-siRNA组绿色信号比转染siRNA-NC组高，表明SCC-15细胞经miR-214表达水平敲低后RASSF5表达水平高于对照组。同理，CAL-27细胞转染miR-214-siRNA组绿色信号比转染siRNA-NC组高，表明CAL-27细胞经miR-214表达水平敲低后RASSF5的表达水平高于对照组。

应用图像处理软件对细胞的平均荧光强度进行量化后，可见敲低后的细胞RASSF5表达水平高于敲低前(P<0.05)，见表4。

3 讨论

miRNA通常作为肿瘤抑制因子或癌基因发挥作用，在某些类型的癌症中经常失调和异常表达，并且它们在致癌过程中起着重要作用。癌症相关miRNA表达改变可成为有价值的诊断标志物，该途径也可能代表多种癌症的新治疗靶点。miR-214由于其在不同类型癌症发展中的关键作用而引起越来越多的关注。在结肠直肠癌中，下调miR-214表达可以减少结肠直肠癌细胞的增殖[9]。在肺癌组织中miR-214被认为显著下调，且功能试验结果证实miR-214在肺癌细胞系中显著抑制细胞生长[10]。然而，miR-214在口腔癌中的作用及潜在的机制仍不清楚。本研究首先用RNA干扰敲低口腔癌细胞株SCC-15和CAL-27中miR-214的表达，在验证RNA干扰实验成功后继续设计细胞功能实验，结果显示miR-214的敲低不仅使细胞的增殖能力降低，并且也降低了口腔癌细胞的迁移和侵袭能力。表明miR-214在口腔癌的发展和进展中可能起着癌基因的作用。

RASSF包含10个成员，RASSF1至RASSF10，并且涉及各种细胞机制，包括细胞凋亡、细胞周期分布和转移。其在多种肿瘤如食管癌、肺癌、乳腺癌等中启动子发生甲基化或表达缺失，导致肿瘤发生发展，并且与肿瘤严重程度及不良预后密切相关[11]。此家族经典子集中RASSF5是鼠类Ras受体Nore1的人类同系物，是唯一同时具有RA和SARAH结构域的RASSF家族成员，目前发现RASFF5在正常组织细胞中广泛表达。体外实验显示，RASSF5在食管鳞状细胞癌[12]和胃贲门腺癌[13]中表达失活，并发生异常高甲基化。说明RASSF5可能是抑癌基因。RASSF5可通过激活MST1信号通路，抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移、侵袭并促进细胞凋亡。然而，目前关于口腔癌中RASSF5表达的数据有限。由于RASSF5在多种肿瘤中可发生异常甲基化而导致表达沉默[14-15]，故本研究拟探讨其与口腔癌的相关性。通过生物学信息预测Ras受体RASSF5基因可能是miR-214作用的靶基因。免疫荧光染色结果显示，在OSCC细胞系中miR-214和RASSF5水平之间发生显著的负调节。表明口腔癌中miR-214表达水平敲低确实导致抑癌基因RASSF5的改变，这一改变的具体调控途径有待于进一步研究，其可为OSCC的治疗提供新思路。

总之，miR-214在OSCC中可能作为癌基因起作用，本研究提示RASSF5可能参与口腔肿瘤的发生发展。

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miR-214在口腔鳞癌细胞中的表达及生物学分析

1 资料与方法

2 结 果

3 讨 论

2 结果

3 讨论