冠心病和肿瘤是严重威胁人类健康的两大疾病。目前，肿瘤合并心肌缺血的发病率大大增加[1]，故寻找对复合性疾病有效的治疗药物或方法迫在眉睫。基于中医的理论，对缺血性疾病和恶性肿瘤2种不同的病理状态，可以用活血化瘀的药物丹参治疗[2]。丹参中的主要成分丹参酮ⅡA既能促进血管生成[3]，又能抑制血管生成[4]。本研究拟建立心肌缺血合并恶性肿瘤的小鼠模型，旨在观察丹参主要活性成分丹参酮ⅡA对心肌缺血合并乳腺癌的作用。
1 材料与方法
1.1 动物、乳腺癌细胞株和试剂 雌性BALB/C-nu 4～6周龄裸鼠30只购于北京华阜康生物科技有限公司。乳腺癌MCF-7细胞购自北京协和细胞库。主要试剂：丹参酮ⅡA(MCE公司)；异丙肾上腺素制剂(上海源叶生物科技有限公司)；CD34抗体(Abcam公司)；vWF抗体(Proteintech公司)；丹酚酸B(MCE公司)；MTT试剂(碧云天生物科技有限公司)。
1.2 试验方法 将传代培养的乳腺癌MCF-7细胞 1×106/200 μL接种于BALB/C-nu雌性裸鼠皮下后，选取成功移植瘤的18只小鼠随机分为3组，即肿瘤模型组、药物丹参酮ⅡA组、药物丹酚酸B组，每组6只。移植瘤第7天后，每组给予腹腔注射异丙肾上腺素2.5 mg/kg，连续注射7 d，制备肿瘤合并心肌缺血动物模型。另设正常对照组6只。各组动物于肿瘤移植7 d后每天定时给药1 次。丹参酮ⅡA组和丹酚酸B组每天腹腔注射给予丹参酮ⅡA、丹酚酸B 200 μL，剂量均为25 mg/kg，1次/d;正常对照组、肿瘤模型组给予等体积生理盐水。连续干预20 d。
1.3 检测指标及方法
1.3.1 肿瘤组织及心肌组织取材 脱颈处死小鼠，取出肿瘤组织、心脏组织，使用4%多聚甲醛固定，24～48 h后进行脱水，浸蜡6 h，制备4 μm厚石蜡切片进行Masson′s Trichrome 染色。
1.3.2 检测肿瘤组织和心肌组织中vWF、CD34蛋白表达水平 采用免疫组织化学技术，按照染色试剂盒的说明书流程进行操作。随机挑选25个镜下视野，在镜下观察到棕黄色颗粒沉积为vWF、CD34阳性表达细胞。蛋白阳性表达指数=细胞阳性染色的平均光密度(OD值)×阳性细胞百分比×100。
1.3.3 MTT法检测丹参有效成分对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)和乳腺癌MCF-7细胞增殖活力的影响 取对数生长期的HUVECs及乳腺癌MCF-7细胞，细胞密度为5×105个/mL，以100 μL/孔接种于96孔培养板中。待细胞贴壁后，饥饿处理24 h。用DMSO溶解丹参酮ⅡA，储存浓度为10 mmol/L；用PBS溶解丹酚酸B，储存浓度为10 mmol/L。将稀释相应浓度的丹参酮ⅡA以100 μL/孔加入相应孔中，对照组加入相应体积的DMSO或PBS，每组5个复孔。48 h后，加入MTS 25 μL/孔，培育2～4 h,在495 nm处检测各孔OD值。
1.4 统计学方法 应用SPSS 15.0统计软件处理数据。计量资料比较分别采用F检验、SNK-q检验及Dunnett-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 药物对心肌胶原纤维和移植瘤的影响 与正常对照组比较，肿瘤模型组心肌胶原纤维面积比明显增多(P<0.05)；与肿瘤模型组比较，丹参酮ⅡA组及丹酚酸B组肿瘤重量和心肌胶原纤维面积比明显降低(P<0.05)；丹参酮ⅡA组心肌胶原纤维面积比较丹酚酸B组降低更多(P<0.05)，但两药物组肿瘤重量差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。
表1 药物对小鼠心肌胶原纤维和移植瘤的影响
Table 1Effect of drugs on myocardial collagen fibers and xenografts in mice
组别心肌胶原纤维面积比(%)肿瘤重量(g)正常对照组2.778±0.351肿瘤模型组27.140±1.010∗0.591± 0.221丹参酮ⅡA组7.340±0.584#0.217±0.043#丹酚酸B组15.760±0.262#△0.339±0.048#F值329.90025.770P值0.0000.000
*P值<0.05与正常对照组比较 #P值<0.05 与肿瘤模型组比较 △P值<0.05 与丹参酮ⅡA组比较(SNK-q检验)
2.2 各组小鼠心肌和肿瘤组织中CD34和vWF蛋白的表达 与正常对照组比较，肿瘤模型组心肌组织中CD34和vWF蛋白表达水平增高(P<0.05)；与肿瘤模型组比较，丹参酮ⅡA组和丹酚酸B组心肌组织中CD34和vWF蛋白表达水平明显升高(P<0.05)，丹参酮ⅡA组心肌组织中CD34和vWF蛋白表达水平较丹酚酸B组更高(P<0.05)。与肿瘤模型组比较，丹参酮ⅡA组和丹酚酸B组肿瘤组织中CD34和vWF蛋白表达水平明显降低(P<0.05)，且丹参酮ⅡA组肿瘤组织中CD34和vWF蛋白表达水平较丹酚酸B组更低(P<0.05)。见表2,图1，2。
表2 药物对小鼠心肌与肿瘤组织中CD34和vWF蛋白表达的影响
Table 2ffects of drugs on the expression of CD34 and vWF proteins in mouse myocardium and tumor tissues
组别CD34表达心肌组织肿瘤组织vWF表达心肌组织肿瘤组织正常对照组1.020±0.4701.040±0.621肿瘤模型组1.140±0.212∗3.750±0.1821.560±0.151∗1.750±0.293丹参酮ⅡA组2.340±0.380#1.610±0.056#3.630±0.103#0.890±0.032#丹酚酸B组1.760±0.193#△2.010±0.065#△2.860±0.120#△0.980±0.011#△F值29.540529.100123.100552.400P值0.0000.0000.0000.000
*P值<0.05与正常对照组比较 #P值<0.05与肿瘤模型组比较 △P值<0.05与丹参酮ⅡA组比较(SNK-q检验)
2.3 丹参酮ⅡA对HUVEC和乳腺癌细胞增殖活力的影响 在正常细胞培养条件下,丹参酮ⅡA能够促进HUVECs的增殖,且存在剂量依赖性，培养24 h时，丹参酮ⅡA剂量在0.25 mg/mL时与空白对照组差异有统计学意义(P<0.05)，并随剂量的增加促进效果显著；培养48 h时，丹参酮ⅡA剂量在2.00 mg/mL开始，与空白对照组差异有统计学意义(P<0.05)，也随剂量的增加促进效果显著。而在缺氧条件下，培养24 h时，丹参酮ⅡA剂量在1.00 mg/mL、2.00 mg/mL、4.00 mg/mL时与空白对照组差异有统计学意义(P<0.05)，存在剂量依赖性；培养48 h时，丹参酮ⅡA剂量在2.00 mg/mL开始，与空白对照组差异有统计学意义(P<0.05)，存在剂量依赖性。在缺氧条件下，不管是培养24 h还是48 h，均在丹参酮ⅡA 0.25 mg/mL剂量时出现了对MCF-7细胞的增殖抑制，这种对MCF-7细胞的抑制随药物剂量增加抑制作用增强。见表3。
表3 丹参酮ⅡA对不同培养条件下HUVECs及MCF-7细胞的作用
Table 3Effects of tanshinone ⅡA on HUVECs and MCF-7 cells under different culture conditions
丹参酮ⅡA剂量正常培养条件下HUVECs增殖24 h48 h缺氧条件下HUVECs增殖24 h48 h缺氧条件下MCF-7增殖24 h48 h空白对照组0.303±0.0250.400±0.0330.45±0.013 0.500±0.0330.450±0.0250.500±0.0230.25 mg/mL 0.312±0.044∗0.433±0.0350.47±0.0240.532±0.0350.372±0.014∗ 0.432±0.015∗0.50 mg/mL0.343±0.012∗0.458±0.0170.51±0.0340.558±0.0910.312±0.044∗0.458±0.041∗1.00 mg/mL0.362±0.045∗0.478±0.0420.56±0.012∗0.578±0.0570.262±0.012∗0.378±0.037∗2.00 mg/mL 0.425±0.045∗0.501±0.013∗0.63±0.032∗0.601±0.014∗0.225±0.022∗0.301±0.024∗4.00 mg/mL 0.427±0.012∗0.523±0.019∗0.63±0.096∗0.623±0.002∗0.227±0.046∗0.223±0.012∗F值284.2005.5083.124394.500102.80084.280P值0.0000.0000.0000.0000.0000.000
*P值<0.05与空白对照组比较(Dunnett-q检验)
3 讨 论
随着人们工作压力的增加、人口老龄化进一步加剧的原因，心血管疾病的发病率和病死率逐年增加。具有活血祛瘀、消炎等功效的丹参是唇形科鼠尾草植物丹参的干燥根部，在临床上主要应用预防和治疗冠心病、心肌梗死等心脑血管疾病[5-6]。丹参的主要分有脂溶性和水溶性两类成分，其中丹参酮ⅡA是丹参的主要有效成分之一，具有抗肿瘤、抗炎、抗感染等作用[7]。有学者提出有活血化瘀作用的中药也具有促进血管生成的作用，进而有利于冠心病患者心脏侧支循环的形成，最终改善心肌缺血缺氧的状态。Wang等[8]建立了大鼠急性心肌梗死模型，研究发现丹参酮ⅡA使得大鼠心肌梗死的面积减少，加强心脏收缩的功能。另有报道，丹参酮ⅡA能通过诱导缺氧诱导因子1α表达上调，促进血管内皮生长因子的表达，从而促进血管生成和减少大鼠心肌梗死面积，提高大鼠存活率[9]。Zhang等[10]用链脲佐菌素建立大鼠糖尿病模型并进行缺血再灌注损伤研究，发现使用丹参酮ⅡA的实验组大鼠与对照组相比,心肌细胞凋亡率明显降低，心肌梗死面积显著减少。本研究结果显示，在小鼠心肌缺血模型中，两药物组心肌胶原纤维面积比明显小于肿瘤模型组，并且丹参酮ⅡA组心肌胶原纤维面积比较丹酚酸B组降低更多，表明在保护心肌缺血的作用中丹参酮ⅡA的效果优于丹酚酸B；另外，丹参酮ⅡA及丹酚酸B可以诱导CD34和vWF的表达，提示丹参酮ⅡA和丹酚酸B能促进心肌组织中微血管的生成量。因为HUVECs具有干细胞的潜能，常常在血管生成研究时应用。本研究选取HUVECs在正常培养和缺氧条件下培养24 h和48 h，模拟细胞在体外的生长情况，观察丹参酮ⅡA对其生长的影响，结果显示无论是在正常条件培养还是在缺氧条件培养，丹参酮ⅡA均能够促进HUVECs的增殖，且呈现浓度剂量依赖性，其可能成为治疗心肌缺血疾病的新手段。
另外，有大量研究结果表明丹参酮ⅡA除了具有心肌保护作用，同时还具有抑制乳腺癌、肾癌、胃癌、结肠癌、肝癌生长的作用。Munagala 等[11]研究证明丹参酮ⅡA可以抑制宫颈癌细胞的生长。有学者研究显示丹参酮ⅡA可通过抑制雄激素受体显著减弱前列腺癌细胞的生长[12]；丹参酮ⅡA可通过调控NF-κB 信号通路抑制MMP的活性,并抑制肝癌的转移和侵袭。P-糖蛋白可增加肿瘤对化疗药物产生耐药[13]，丹参酮ⅡA通过下调P-糖蛋白的表达水平，对抗紫杉醇的耐药性，进而达到治疗肿瘤的目的。同时，丹参酮ⅡA通过下调PKM2表达促进慢性髓细胞白血病细胞凋亡[14]。丹参酮ⅡA 可以通过破坏脱氧核酸嘧啶内切酶的功能，抑制肿瘤细胞的生长，促进肿瘤细胞的凋亡[15]。本研究结果显示丹参酮ⅡA在肿瘤合并心肌缺血动物模型中可有效抑制乳腺癌肿瘤的生长以及肿瘤组织中CD34及vWF的表达，表明丹参酮ⅡA和丹酚酸B能抑制移植瘤组织中微血管的生成；同样，选取MCF-7乳腺癌细胞在体外模拟肿瘤生长环境，发现丹参酮ⅡA能够抑制乳腺癌细胞的增殖,且存在剂量依赖性，可见丹参酮ⅡA对心肌缺血及恶性肿瘤的双向作用可能与其双向调节血管生成相关。表明丹参可能成为预防治疗肿瘤合并心血管疾病的新药物。(本文图见封三)
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