大鼠骨组织中IRS-2 mRNA水平与2型糖尿病性骨质疏松发病的关系

从2013年起，我国已经成为世界上2型糖尿病患者最多的国家，预计这种状况将维持至2030年[1-2]。2型糖尿病能够导致骨质疏松症，近年来被国内外研究者广泛关注[3]。胰岛素受体底物2(insulin receptor substrate-2，IRS-2)是胰岛素信号转导途径中重要的信号分子，介导胰岛素发挥正常功能[4-5]。IRS-2基因缺失可影响胰岛素信号传递，降低机体胰岛素敏感性[6]。本研究通过高脂喂养+卵巢摘除建立2型糖尿病性骨质疏松大鼠模型，旨在探讨IRS-2在2型糖尿病性骨质疏松发生发展过程中的作用。

1 材料与方法

1.1 动物及其主要试剂链脲佐菌素购自美国Sigma公司；Trizol试剂和SYBR Green 试剂盒分别购自Invitrogen公司和TaKaRa公司；IRS-2和β-actin引物由上海生物工程有限公司合成。酶联免疫测定仪(南京华东电子集团公司)，台式高速低温离心机(美国Thermo公司)，紫外分光光度计(美国Appendorf公司)，-80 ℃深低温冰箱(美国Thermo公司)，纯水系统(美国MILLIPORE公司)，罗氏血糖仪(上海罗氏公司)，梯度基因扩增仪(TaKaRa公司)，实时定量PCR仪(美国伯乐公司)。常规饲料和高脂饲料(20%蔗糖、15%熟猪油、2.5%胆固醇)均购自中国人民解放军联勤保障部队第980医院实验动物中心。清洁级雌性3月龄Wistar大鼠64只，由河北省实验动物中心提供。实验大鼠喂养于清洁级动物房，饲养条件维持室温18～24 ℃、相对湿度55%～65%，12 h交替照射。随机将大鼠分为4组：正常对照(normal controls，NC)组、去卵巢(normal ovariectomy,NOVX)组、2型糖尿病(diabetes mellitus，DC)组和2型糖尿病合并去卵巢(diabetes ovariectomy,DOVX)组，每组16只。各组体重差异无统计学意义(P>0.05)。NC组和NOVX组用正常饲料喂养，DC组和DOVX组用高脂饲料(含45%高脂)喂养，NOVX组和DOVX组行双侧卵巢切除手术，喂养8周后，DC组和DOVX组大鼠禁食12 h，腹腔注射链脲佐菌素(30 mg/kg)，1周后检查大鼠空腹血糖。以空腹血糖>7.0 mmol/L认定为大鼠2型糖尿病造模成功。继续喂养大鼠1周后，使用10%水合氯醛(4 mL/kg)通过腹腔注射麻醉DOVX组和NOVX组大鼠并行双侧卵巢切除术。于去卵巢手术后继续喂养所有大鼠12周。分别于手术后0周(手术当天)、4周、8周、12周末测量大鼠的体重、骨密度、空腹血糖及胰岛素水平，并且计算胰岛素敏感指数。所有动物实验均遵守动物伦理要求。

1.2 大鼠骨骼组织中IRS-2表达水平检测分别在去卵巢手术后4周、8周和12周从各实验组中选取4只大鼠，麻醉处死后分离股骨和肱骨。使用Trizol提取总RNA，测定RNA浓度并取2 μg RNA逆转合成cDNA。逆转录反应体系如下：2 μL RNA(1 μg/μL)、2 μL Oligo dT、2 μL dNTP(10 mmol/L)和4 μL DEPC水，混合均与后于70℃孵育10 min，冷却至4 ℃。继续加酶反应体系：2 μL 10×Buffer、1 μL RNA酶抑制剂、1 μL M-MuLV逆转录酶和 6 μL DEPC水，42 ℃反应 60 min、95 ℃反应5 min，冷却至4℃。以cDNA为模板使用SYBR Green试剂盒(TaKaRa)采用实时定量PCR法检测各组大鼠骨组织IRS-2 mRNA 表达。实时定量PCR反应体系如下所述：2 μL 10倍稀释后cDNA、上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL、10 μL SYBR Green 和6.4 μL超纯水，混合均匀。反应程序如下：95 ℃孵育10 min，然后进入循环反应95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共进行40个循环。以β-actin为内参照，计算目的基因mRNA表达量。采用△Ct法处理结果，计算相对表达量，即2-△△Ct。所有数据处理时以对照组的平均数为准对其他各组数据进行标准化，以求得相对表达水平。PCR引物序列如下：IRS-2 forward primer，5′-CCACACACCTGT-CCTCATTG-3′；IRS-2 reverse primer，5′-TAAT-CCGCTTTGCCAAAATC-3′；β-actin forward primer，5′-ACGGTCAGGTCATCACTATC-3′；β-actin reverse primer，5′-TAGAGCCACCAATCC-ACAC-3′。

1.3 统计学方法应用SPSS 13.0统计软件分析数据。计量资料比较分别采用F检验和SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠检测指标比较使用高脂饲料喂养大鼠8周后腹腔注射链脲菌素，摘除双侧卵巢后继续饲养12周，成功构建2型糖尿病性骨质疏松大鼠模型，测量大鼠体重、空腹血糖及胰岛素水平，并且计算胰岛素敏感指数。NOVX组体重与NC组差异无统计学意义(P>0.05)，DC组和DOVX组体重均较NC组和NOVX组降低(P<0.05)；DC组和DOVX组空腹血糖和空腹胰岛素水平均较NC组和NOVX组增加(P<0.05)；DC组和DOVX组胰岛素敏感指数均较NC组和NOVX组降低(P<0.05)。见表1。

表1 成模时各组大鼠体重、空腹血糖和胰岛素水平以及胰岛素敏感指数比较
Table 1Comparison of body weight，fasting blood glucose and insulin level and insulin sensitive index among groups

2.2 各组不同时点骨密度比较分别于巢摘除手术后0周、4周、8周和12周检测大鼠骨密度,每个时点4只。在0周和4周时，各组之间骨密度水平差异无统计学意义(P>0.05)；8周时，NOVX组和DOVX组骨密度均较NC组降低(P<0.05)；12周时，NOVX组、DC组和DOVX组骨密度均较NC组降低(P<0.05)。NOVX组和DOVX组随着去卵巢时间增长，骨密度逐渐降低，4周、8周和12周与0周相比骨密度显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 各组不同时点骨密度比较
Table 2Comparison of bone mineral density at different time points among groups

2.3 各组不同时点IRS-2 mRNA比较分别于巢摘除手术后4周、8周和12周收集大鼠骨骼组织，提取RNA采用实时定量PCR法检测IRS-2 mRNA水平。4周、8周和12周时，NOVX组和DOVX组IRS-2 mRNA水平均较NC组降低(P<0.05)，DOVX组IRS-2 mRNA水平较DC组降低(P<0.05)；只有在12周时，DC组IRS-2 mRNA水平较NC组降低(P<0.05)。DC组和DOVX组随着去卵巢时间增长，IRS-2 mRNA水平逐渐降低，8周和12周与4周相比IRS-2 mRNA水平显著降低，12周与8周比降低(P<0.05)。见表3。

表3 各组不同时点IRS-2 mRNA比较
Table 3Comparison of levels of IRS-2 mRNA at different time points among groups

*P值<0.05与NC组比较 #P值<0.05与DC组比较 aP值<0.05与4周比较 bP值<0.05与8周比较(SNK-q检验)

3 讨论

随着社会老龄化加剧和生活方式的改变，我国2型糖尿病患病率逐年增高[7]。2型糖尿病是一种内分泌代谢性疾病，能够引起机体多个器官的病变[5,8]。2型糖尿病患者血糖升高可导致视网膜病变、神经病变、肾病和大血管病变[5]。2型糖尿病性骨质疏松症是2型糖尿病常见的一种并发症。骨质疏松症被称为“静默的流行病”，多见于绝经后妇女和老年男性[9-10]。骨质疏松症是一种代谢性骨骼组织病变，以骨密度减少、骨质变差和骨骼组织微观结构破坏为主要病理特征[8]。骨质疏松症患者骨脆性增加，引起全身骨骼疼痛，易发骨折。骨质疏松症及其所引起的骨折是导致全球老年人致残和失能的重要原因[11]。近年来，2型糖尿病性骨质疏松症被国内外研究者广泛关注。因此，研究2型糖尿病性骨质疏松症发病机制，对其防治具有重要意义。

胰岛素受体底物(insulin receptor substrate,IRS)是受体酪氨酸激酶的底物，介导胰岛素信号传递[9,12]。当胰岛素与其靶细胞的表面受体α亚基结合后，活化β亚基的酪氨酸蛋白激酶，从而使IRS-2发生酪氨酸磷酸化激活PI3K/Akt通路，最后导致GLUT4的细胞膜转位而促进葡萄糖的利用。IRS家族包括IRS-1、IRS-2、IRS-3和IRS-4。IRS-3主要在脂肪组织中表达，IRS-4主要在胸腺、脑和肾脏中表达[4]。IRS-1和IRS-2广泛表达于各个组织中，在成骨细胞和破骨细胞中也有表达，对骨代谢起重要调控作用[13-15]。IRS-2是胰岛素信号通路的重要转导分子，通过激活 PI3K信号通路发挥作用。抑制IRS-2蛋白表达可影响胰岛素信号传递,降低胰岛素敏感性[16]。IRS-2缺失能够导致机体血糖升高、脂肪代谢及肝糖异生异常，引起机体胰岛素抵抗，使机体更易发展为糖尿病[17-18]。本研究通过高脂喂养和腹腔注射链脲菌素建立2型糖尿病模型，并且通过切除双侧卵巢模拟雌激素缺失，构建2型糖尿病性骨质疏松大鼠模型，在不同时间点采用实时定量PCR法检测对照组和疾病组大鼠骨组织中IRS-2 mRNA表达变化，结果显示4周、8周和12周时，NOVX组和DOVX组IRS-2 mRNA水平较NC组降低(P<0.05)，DOVX组IRS-2 mRNA水平较DC组降低(P<0.05)；DC组和DOVX组随着去卵巢时间增长，IRS-2 mRNA水平逐渐降低，8周和12周与4周相比IRS-2 mRNA水平显著降低，12周与8周比降低。表明在2型糖尿病性骨质疏发病过程中随着骨密度降低，骨组织中IRS-2 mRNA水平降低。

总之，IRS-2与机体骨代谢密切相关。IRS-2是成骨细胞中胰岛素和IGF-1信号转导通路中的重要介质。IRS-2基因敲除小鼠成骨细胞增殖分化能力下降，RANKL表达减少，导致破骨细胞骨吸收增强。当机体骨形成小于骨吸收时，呈现低代谢转换型骨质疏松。雌激素缺失能够导致骨密度降低[19]。切除大鼠双侧卵巢后，骨密度较正常对照组明显减低，成骨细胞中IRS-2表达下降[20]。因此，2型糖尿病性骨质疏松大鼠骨组织胰岛素信号通路中IRS-2对糖代谢和骨代谢均发挥着重要作用。

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大鼠骨组织中IRS-2 mRNA水平与2型糖尿病性骨质疏松发病的关系

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

Relationship between IRS-2 mRNA level in rat bone tissue and osteoporosis in type 2 diabetes mellitus

2 结果

3 讨论