类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种以关节滑膜病变为主要特征的慢性全身免疫性疾病，其基本病理变化是机体内炎症细胞因子的大量释放、滑膜衬里细胞增生、血管翳的形成以及软骨和骨组织的破坏。RA临床特征表现为慢性对称性关节肿痛、滑膜炎、关节部位压痛伴有晨僵[1]。我国RA发病率呈明显升高趋势，该病具有反复发作、病程长的特点，随着病程的进展，滑膜增生可造成关节畸形，严重危害身体健康[2]。目前，RA的治疗以非甾体抗炎药、抗风湿药和糖皮质激素等为主，但长期服用引起的不良反应会影响患者治疗的依从性和疗效[3]。随着靶向促炎因子、信号通路等治疗方法的兴起，RA治疗已步入分子靶向治疗新时代[4-5]。本研究观察miR-146对滑膜成纤维细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)及PI3K/Akt信号通路的影响，旨在寻找新的RA分子治疗靶点。
1 材料与方法
1.1 材料 本研究所用的MH7A细胞为一种常用的RA患者原代FLS细胞，购自广州吉尼欧生物有限公司；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)购自美国Sigma公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；总RNA提取纯化试剂盒、Lipofectamine 2000试剂购自美国Invitrogen公司；白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒购自武汉伊莱瑞特有限公司；甘油醛3-磷酸脱氢酶、PI3K、Akt 和磷酸化(p)-Akt抗体购自美国CST公司；磷酸盐缓冲液、DMEM培养基、辣根过氧化物酶标记的二抗、BCA蛋白测定试剂盒、ECL超敏发光液、RIPA裂解液、噻唑蓝、Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒购自中国Beyotime公司；聚偏氟乙烯膜购自美国Milipore公司；miR-146 购自上海吉玛基因有限公司；miR-146、GAPDH、PI3K和Akt引物购自生工生物工程(上海)股份有限公司。
1.2 细胞培养与传代及分组 将RA-FLS细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，培养箱条件设置为37 ℃、5% CO2。细胞贴壁生长至80%左右时，消化后以1∶2比例传代，取对数生长期的细胞用于实验。将RA-FLS细胞接种于6孔板(1×106/孔)，分为对照组、LPS组和LPS+miR-146 组。待细胞贴壁后，LPS+miR-146 组采用Lipofectamine 2000转染miR-146 ，转染6 h后，PBS溶液洗涤5次。然后，LPS组和LPS+miR-146 组更换为含1 μg/mL LPS的DMEM培养基，对照组更换为不含LPS的DMEM培养基，孵育24 h。实验重复3次。
1.3 观察RA-FLS细胞增殖活力 LPS+miR-146组在6孔板中转染6 h后，将各组细胞转移至96孔板，每组5个复孔。LPS孵育24 h后，倾去上清液，PBS洗涤3次，每孔加入10 μL的MTT溶液，孵育4 h后，采用MTT法于490 nm处测定吸光度，比较RA-FLS细胞增殖活力变化。
1.4 检测RA-FLS细胞凋亡 将细胞密度调整为1×106/mL，离心后用PBS洗涤，并重悬于结合缓冲液中，然后加入Annexin V-FITC，并将细胞在冰上避光孵育15 min。在检测前2 min，加入PBS和PI，采用流式细胞术在BD FACSCanto Ⅱ流式细胞仪上进行检测。
1.5 检测炎症因子含量 6孔板中LPS孵育24 h后，将上清液1000 r/min离心10 min，弃去沉淀。将上清液加入酶标板中(每孔100 μL)，37 ℃孵育1.5 h，然后加入生物素化抗体工作液孵育60 min。洗涤3次，酶结合物工作液孵育30 min。洗涤5次，加入底物溶液孵育15 min左右，然后加入终止液，应用ELISA法酶标仪在450 nm处进行检测。根据标准曲线，计算相应样品浓度。
1.6 检测miR-146、PI3K及Akt mRNA表达 利用Trizol试剂提取6孔板中细胞总RNA，经DNase I纯化后，将总RNA逆转录得到cDNA，可保存于-20 ℃备用。然后采用RT-PCR法按照Real-time PCR试剂盒说明书，以cDNA为模板，分别加入对应引物进行扩增，以GAPDH为对照，计算PI3K及Akt mRNA相对表达。
1.7 检测PI3K、Akt和p-Akt蛋白表达 将LPS孵育24 h的细胞弃去上清液，PBS洗涤后，采用RIPA裂解液提取细胞总蛋白质，BCA工作液测定总蛋白含量。采用蛋白免疫印迹法，用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离蛋白，然后将蛋白条带转移至PVDF膜上，10%脱脂牛奶室温孵育2 h。将PVDF膜分别与GAPDH(1∶1 000)、PI3K(1∶1 000)、Akt(1∶1 000)及p-Akt(1∶500)抗体稀释液4 ℃孵育过夜，然后与辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2 h，蛋白条带通过ECL超敏发光液显影。
1.8 统计学方法 应用SPSS 19.0统计软件分析数据。计量资料比较分别采用F检验和SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 miR-146转染对RA-FLS细胞miR-146表达的影响 与对照组比较，LPS组RA-FLS细胞中miR-146表达降低(P<0.05)；与LPS组比较，LPS+miR-146组细胞miR-146表达明显增加(P<0.05)。见表1。
表1 miR-146转染对RA-FLS细胞miR-146表达的影响
Table 1Effects of miR-146 transfection on the expression of miR-146 in RA-FLS cells
组别miR-146表达对照组0.84±0.07LPS组0.46±0.05∗LPS+miR-146组16.21±1.48#F值22.183P值0.000
*P值<0.05与对照组比较 #P值<0.05与LPS组比较(SNK-q检验)
2.2 miR-146对RA-FLS细胞增殖和凋亡的影响 与对照组比较，LPS组RA-FLS细胞活力明显升高(P<0.05)，而细胞凋亡率明显下降(P<0.05)；与LPS组比较，LPS+miR-146组细胞增殖活力明显下降(P<0.05)，而细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。见表2。
2.3 miR-146对RA-FLS细胞炎症因子的影响 与对照组比较，LPS组上清液中IL-1β、IL-6和TNF-α含量明显增加(P<0.05)；与LPS组比较，LPS+miR-146 组IL-1β、IL-6和TNF-α含量明显下降(P<0.05)。见表3。
表2 miR-146对RA-FLS细胞增殖和凋亡的影响
Table 2Effects of miR-146 on proliferation and apoptosis of RA-FLS cells
组别细胞活力(OD值)凋亡率(%)对照组0.58±0.0212.67±1.36LPS组0.91±0.03∗7.67±0.83∗LPS+miR-146组0.72±0.03#10.98±0.74#F值4.4638.832P值0.0140.002
*P值<0.05与对照组比较 #P值<0.05与LPS组比较(SNK-q检验)
表3 miR-146对RA-FLS细胞炎症因子的影响
Table 3Effects of miR-146 on inflammatory cytokines in RA-FLS cells
组别IL-1βIL-6TNF-α对照组8.76±0.7385.46±9.3714.38±1.53LPS组26.48±2.55∗258.47±27.74∗55.49±6.12∗LPS+miR-146组16.54±1.08#167.49±18.64#34.19±3.84#F值17.89324.32018.329F值0.0000.0000.000
*P值<0.05与对照组比较 #P值<0.05与LPS组比较(SNK-q检验)
2.4 miR-146对RA-FLS细胞PI3K及Akt mRNA的影响 与对照组比较，LPS组PI3K mRNA表达明显上调(P<0.05)；与LPS组相比，LPS+miR-146 组PI3K mRNA表达明显下调(P<0.05)。而各组之间Akt mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。
表4 miR-146对RA-FLS细胞PI3K及Akt mRNA的影响
Table 4Effects of miR-146 on PI3K and Akt mRNA in RA-FLS cells
组别PI3K mRNAAkt mRNA对照组0.62±0.050.86±0.09LPS组1.08±0.09∗0.95±0.08LPS+miR-146 组0.84±0.07#0.83±0.06F值5.7011.673F值0.0080.538
*P值<0.05与对照组比较 #P值<0.05与LPS组比较(SNK-q检验)
2.5 miR-146对RA-FLS细胞PI3K、Akt 和p-Akt蛋白的影响 与对照组比较，LPS组PI3K和p-Akt蛋白表达水平明显上调(P<0.05)；与LPS组相比，LPS+miR-146 组PI3K和p-Akt蛋白表达水平明显下调(P<0.05)。而各组之间总Akt蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。
表5 miR-146对RA-FLS细胞PI3K、Akt和p-Akt蛋白的影响
Table 5Effects of miR-146 on PI3K,Akt and p-Akt proteins in RA-FLS cells
组别PI3K总Aktp-Akt对照组0.92±0.100.72±0.080.81±0.09LPS组1.51±0.12∗0.69±0.071.54±0.13∗LPS+miR-146组1.21±0.11#0.78±0.091.18±0.12#F值7.5521.1328.104P值0.0050.8250.003
*P值<0.05与对照组比较 P值<0.05与LPS组比较(SNK-q检验)
3 讨 论
RA最典型的病理特征为慢性滑膜炎，在病程进展阶段，炎性因子等可持续激活细胞内蛋白激酶，继而导致滑膜细胞增殖与凋亡紊乱。研究表明，FLS细胞的类肿瘤样增殖和大量分泌促炎性细胞因子等特性，可造成RA关节内炎性细胞聚集、滑膜组织增生、骨及软骨降解和破坏等[6]。本研究所用的MH7A细胞是一种常用的RA患者原代FLS细胞，异常免疫信号刺激可诱导FLS细胞分泌大量炎性因子，是关节腔内局部炎症反应的主要原因，如LPS刺激可促进FLS细胞异常增殖，并诱发炎症反应[7-8]。
TNF-α、IL-1β等炎症因子对新生血管具有调节作用，不仅会加重炎症反应，还会促进滑膜血管翳的形成，侵蚀关节软骨、软骨下骨、韧带肌腱等组织[9]。TNF-α和IL-1β在炎症反应中占据重要地位，能够促进IL-6等炎症介质的产生，诱导炎症细胞浸润滑膜组织，导致滑膜组织增生，继而加重关节病理破坏[10-11]。研究表明，LPS刺激FLS细胞可模拟RA体内环境，是体外研究RA发病机制及治疗方法的重要细胞模型[12]。本研究结果表明，LPS刺激可明显下调miR-146表达，且增加FLS细胞上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6促炎因子含量，并促进细胞增殖且抑制细胞凋亡，表明LPS刺激FLS细胞可较好地模拟RA体内环境。转染miR-146 后，FLS细胞中miR-146表达明显增加。miR-146高表达可减少FLS细胞释放TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子，并且抑制细胞增殖能力，还能够促进细胞发生凋亡，表明miR-146对于FLS细胞生物学行为具有重要调控作用。
PI3K是一种参与细胞生长及骨架重塑的重要磷脂酰肌醇激酶，也是重要的抗凋亡调节因子，活化后可导致脂质底物磷酸化并激活下游Akt，通过磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白 Caspase3、NF-κB、mTOR等，参与调节细胞凋亡与代谢过程。PI3K/Akt信号通路可转导能量代谢、生长因子等相关胞外信号，广泛参与基因转录、蛋白质翻译、核糖体合成等生物学过程，在细胞增殖、凋亡、迁移等生理过程中起重要调节作用[13]。体外研究表明，PI3K/Akt信号通路活化与FLS细胞增殖、凋亡和炎症反应密切相关[14-15]。PI3K/Akt信号通路不仅能被TNF-α等炎症因子激活，进而调控FLS细胞增殖能力，而且还能够促进炎症因子相关信号通路的活化，引起TNF-α、IL-1β和IL-6等促炎因子大量释放，形成正反馈调节，持续诱发FLS细胞异常增殖和炎症反应，加重RA病情，故该通路具有成为治疗RA分子靶通路的潜力[16-17]。同时，有研究发现miR-146能够抑制PI3K/Akt通路的激活，起到抑制炎症反应的作用[18]。本研究结果显示，miR-146表达可抑制PI3K/Akt信号通路活化。表明miR-146可能通过PI3K/Akt通路调控FLS细胞增殖、凋亡及炎症反应的分子机制。
综上所述，miR-146能够调控FLS细胞增殖、凋亡及炎症反应，其分子机制可能与调控PI3K/Akt信号通路活化相关，但生物信息学软件分析结果显示PI3K并非为miR-146的直接靶基因。推测miR-146对PI3K/Akt通路的调控作用可能与其他分子靶标有关。因此，本研究将继续尝试探索miR-146对PI3K/Akt通路调控作用的具体分子机制。
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