胃癌组织中TPX2与肿瘤细胞铂类药物耐药的关系及意义

胃癌是我国常见的消化道恶性肿瘤，该病进展快、预后差，是危害人民健康较大的疾病[1]。胃癌的治疗措施主要包括手术和化疗，但由于胃癌细胞对化疗药物存在明显的耐药性，往往导致胃癌治疗失败。铂类药物中的顺铂(cisplatin，CDDP)、奥沙利铂(oxaliplatin，L-OHP)是胃癌化疗中的常用药物，而耐药性的存在严重影响了铂类药物的效果[2-3]，迄今胃癌对铂类药物耐药的机制并不完全明确。Xklp2靶蛋白(targeting protein for Xklp2,TPX2)是一种微管驱动蛋白，参与细胞的有丝分裂[4]。有研究表明TPX2与肿瘤在内的多种疾病有关[5]。本研究检测胃癌及癌旁正常组织中TPX2表达情况，以及CDDP、L-OHP对不同组织肿瘤细胞的抑制情况，同时检测耐药相关蛋白P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、谷胱甘肽S转移酶π(glutathione S transferase-π,GST-π)、B淋巴细胞/白血病2(B lymphatic leukaemia 2,Bcl-2)的表达，旨在探讨TPX2与胃癌铂类药物耐药的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2013年1月—2015年12月在峰峰集团邯郸医院普通外科确诊为胃癌并行手术治疗的患者85例，均有完整的临床病理记录。接受术前化疗(方案为XELOX)者25例，男性18例，女性7例，年龄38～75岁，平均(56.9±9.9)岁；未接受术前化疗直接手术者60例，男性43例，女性17例，年龄32～74岁，平均(57.5±9.0)岁。另在未接受化疗的患者中取癌旁正常组织(距肿瘤边缘>3 cm，术后病理证实为正常黏膜)为癌旁正常组织30例，男性23例，女性7例，年龄29～72岁，平均(54.4±8.4)岁。患者的组织学分型为中高分化腺癌66例，低分化腺癌19例；按UICC分期：Ⅰ期8例，Ⅱ期15例，Ⅲ期52例，Ⅳ期10例。

1.2 标本制备所有患者均经手术切除原发肿瘤。术中取肿瘤组织一式两份：一份以PBS漂洗后200目铜网过滤制备单细胞悬液原代培养后用于化疗药物敏感性试验；另一份置于10%中性甲醛中固定、包蜡，用于免疫组织化学检测。

1.3 主要试剂 MTT由美国Sigma公司提供；DMEM培养基、胎牛血清由美国HyClone公司提供；CDDP由齐鲁制药公司提供(10 mg/支，批准文号为H37021356)；L-OHP由恒瑞制药公司提供(50 mg/支，批注文号为H20000337)；TPX2、P-gp、GST-π、Bcl-2抗体由美国Sigma公司提供，免疫组织化学试剂盒购自博士德公司。

1.4 MTT法检测胃癌细胞对CDDP、L-OHP的体外敏感性胃癌单细胞悬液调整浓度为5×104 cells/mL接种于96孔板，培养24 h待细胞贴壁生长时换液并分别加入CDDP(0.5 μg/mL)、L-OHP(150 μg/mL)后继续培养24 h。每组设4个复孔。加药后20 h时加入MTT(5 mg/mL)。继续培养4 h弃去上清液，每孔加入150 μL者DMSO在室温下振荡15 min。在酶标仪490 nm处读取吸光值(A值)并计算细胞抑制率。细胞抑制率(%)=1-(实验组A值/对照组A值)×100%。

1.5 TPX2、P-gp、GST-π、Bcl-2蛋白在肿瘤及癌旁组织中的表达按免疫组织化学试剂盒说明书检测胃癌及癌旁组织中TPX2、P-gp、GST-π、Bcl-2蛋白的表达情况。TPX2在细胞核表达，P-gp在细胞膜及细胞浆表达，GST-π、Bcl-2蛋白在细胞浆内表达。以相应部位出现黄色或棕黄色染色颗粒为阳性。在400倍视野下读片，每张切片取5个视野，随机计数100个细胞并计分。采用二步法计分方式：首先按染色强度计分，无色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕色为3分；然后按细胞百分数计分，阳性细胞数<25%计为0分，25%～50%计为1分，>50%～75%计为2分，>75%计为3分。二者相加即为表达强度：0分为阴性(-)，1～2分为弱阳性(+)，3～4分为阳性(++)，5～6分为强阳性(+++)。

1.6 统计学方法应用SPSS 13.0统计软件处理数据。计数资料比较采用χ2检验；计量资料比较分别采用两独立样本的t检验、F检验及SNK-q检验；相关性采用直线相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CDDP和L-OHP对3组细胞的抑制率比较术前化疗组和术前未化疗组对CDDP和L-OHP的抑制率均低于癌旁正常组织，术前化疗组细胞对CDDP和L-OHP的抑制率又低于术前未化疗组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2 CDDP、L-OHP对肿瘤细胞抑制率与TPX2蛋白表达的关系胃癌患者中TPX2阳性者细胞对CDDP和L-OHP的抑制率低于TPX2阴性者，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.3 3组TPX2、P-gp、GST-π、Bcl-2蛋白表达比较术前化疗组和术前未化疗组TPX2、P-gp、GST-π和Bcl-2蛋白表达均高于癌旁正常组织，术前化疗组TPX2蛋白的表达又均高于术前未化疗组，差异有统计学意义(P<0.05),见表3。

表1 CDDP、L-OHP对3组细胞的抑制率比较
Table 1Comparison of inhibition rates of CDDP and L-OHP among three groups

*P值<0.05与癌旁正常组织组比较 #P值<0.05与术前未化疗组比较(SNK-q检验)

表2 CDDP、L-OHP对肿瘤细胞抑制率与TPX2蛋白表达的关系
Table 2Relationship between inhibition of CDDP,L-OHP to cancer cells and expression of TPX2 protein

*P值<0.05与术前化疗组比较 #P值<0.05与术前未化疗组比较(χ2检验)

2.4 TPX2、P-gp、GST-π、Bcl-2蛋白与胃癌及癌旁正常组织表达的相关性术前化疗组TPX2表达与Bcl-2呈正相关(r=0.635,P=0.001)，TPX2表达与P-gp、GST-π无相关关系(r=0.346,P=0.061；r=0.165,P=0.384)。术前未化疗组TPX2表达与P-gp、Bcl-2呈正相关(r=0.523,P<0.001；r=0.412,P=0.001)，TPX2表达与GST-π无相关关系(r=0.285,P=0.127)。癌旁正常组织组TPX2与P-gp、TPX2与GST-π、TPX2与Bcl-2无相关关系(r=0.524,P=0.198；r=0.301,P=0.107；r=0.276,P=0.140)。

3 讨论

胃癌在我国发病率、病死率均较高，预后较差，治疗效果不满意。目前针对胃癌是采取手术、化疗、放疗及靶向治疗等措施在内的综合治疗，其中化疗是手术外最重要的治疗措施，发挥了重要的治疗作用，但胃癌细胞对多种化疗药物存在药物耐受能力，即多药耐药性，往往严重影响胃癌化疗效果，导致化疗失败、肿瘤复发、转移[6]。胃癌常用化疗方案中，铂类药物是主要的一类药物。胃癌细胞同样对铂类药物存在明显的抵抗作用，胃癌细胞的这种能力严重影响了铂类药物的化疗效果[2-3]。因此，了解胃癌细胞对铂类药物的耐药机制对预测化疗效果、寻找化疗逆转靶蛋白意义重大，而迄今这方面的研究还没有突破性进展。TPX2蛋白是近年来发现的与肿瘤关系密切的蛋白质，其生理功能是促进细胞有丝分裂，并在DNA损伤时进行修复。研究表明，TPX2在食管癌组织中的阳性表达率高于食管的不典型增生组织及正常上皮组织[7]。在乳腺癌组织中TPX2的mRNA和蛋白的表达比癌旁组织及正常乳腺组织均明显增高[8]。对胃癌的研究发现，TPX2蛋白在正常胃黏膜、癌旁组织及胃腺癌组织中依次增高，且其表达与肿瘤的一些病理学参数有关，是反映肿瘤进展转移的指标[9]。还有研究发现，结肠腺癌组织中TPX2蛋白表达比正常结肠黏膜组织增强，与肿瘤的进展及淋巴结转移有关，且与Ki-67表达存在正相关[10]。这些研究均显示TPX2在多种恶性肿瘤中存在异常表达，具有促进肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞凋亡的作用，属于原癌基因。本研究结果显示TPX2在胃癌组织中的表达阳性率高于癌旁组织。表明TPX2可能在胃癌的发生、进展中发挥了作用，与其他报道结果相符。

本研究进一步分析还发现CDDP、L-OHP对肿瘤细胞的抑制率低于对癌旁组织细胞的抑制率，证实胃癌肿瘤细胞对CDDP、L-OHP有抵抗力。有研究发现PTX2与非霍奇金淋巴瘤的化疗敏感性有关[11]，但PTX2与胃癌耐药是否有关报道尚少。本研究结果显示TPX2阳性表达者CDDP、L-OHP对肿瘤细胞的抑制率低于阴性者，说明TPX2表达有可能是肿瘤细胞耐药性增强的原因。本研究还显示术前接受新辅助化疗者组织TPX2表达比未接受化疗者阳性率更高，对CDDP、L-OHP的耐药性也更强，说明在化疗过程中肿瘤细胞对CDDP、L-OHP的抵抗能力进一步增强，这一过程中TPX2可能发挥了作用，是导致胃癌细胞铂类药物耐药性增强的原因。

为了解PTX2在胃癌铂类药物耐药形成中发挥的作用，本研究进一步检测了耐药相关蛋白P-gp、GST-π、Bcl-2在不同组织中的表达情况并分析了TPX2与这些蛋白的关系。P-gp是目前研究较多的经典耐药蛋白，主要通过药泵功能将进入细胞的化疗药物通过主动转运排出细胞外[6,12]。GST-π存在于肿瘤细胞的胞浆中，可以通过代谢作用将进入细胞的化疗药物分解为无毒物质[13-14]。Bcl-2是调控细胞凋亡线粒体途经中的重要成员，其主要作用是增强肿瘤细胞的凋亡抵抗能力而使其难以发生凋亡，在铂类药物的耐药形成中发挥了重要作用[15-16]。本研究结果显示在未经术前治疗的胃癌组织中TPX2与P-gp、Bcl-2有正相关关系，表明在胃癌组织中PTX2可能通过调节P-gp、Bcl-2的表达而参与了胃癌对铂类药物耐药性的形成。本研究结果还发现术前接受过新辅助化疗的患者肿瘤组织中TPX2仅与Bcl-2表达有关，这种关系与未经术前治疗的胃癌组织不同。这一结果提示化疗过程中肿瘤细胞的耐药性和TPX2表达均发生了变化，TPX2调节耐药性的方式可能也发生了改变，但尚待深入研究予以证实。

总之，PTX2在胃癌组织中表达增强，在化疗后表达进一步增强；PTX2与胃癌细胞的铂类药物耐药性及部分耐药相关蛋白表达有关。提示PTX2蛋白可能通过调控部分耐药相关蛋白而参与了胃癌对铂类药物耐药，且在化疗过程中其自身表达及其与耐药相关蛋白的关系均发生了变化。PTX2蛋白在胃癌铂类药物耐药形成中发挥了重要作用，但由于其中关系较为复杂，且本研究未涉及深入的机制研究，因而尚存在不足，具体的机制还有待大规模的临床及基础研究予以探讨。

[1] Chen W,Zheng R,Zeng H,et al.The updated incidences and mortalities of major cancers in China,2011[J].Chin J Cancer,2015,34(3):502-507.

[2] Sun XP,Dong X,Lin L,et al.Up-regulation of survivin by AKT and hypoxia-inducible factor 1α contributes to cisplatin resistance in gastric cancer[J].FEBS J,2014,281(1):115-128.

[3] Zhao Q,Li Y,Tan BB,et al.HIF-1α induces multidrug resistance in gastric cancer cells by inducing MiR-27a[J].PLoS One,2015,10(8):e0132746.

[4] Liang B,Jia C,Huang Y,et al.TPX2 level correlates with hepatocellular carcinoma cell proliferation,apoptosis,and EMT[J].Dig Dis Sci,2015,60(8):2360-2372.

[5] Miwa T,Kokuryo T,Yokoyama Y,et al.Therapeutic potential of targeting protein for Xklp2 silencing for pancreatic cancer[J].Cancer Med,2015,4(7):1091-1100.

[6] Zhao YY,Yu L,Liu BL,et al.Downregulation of P-gp,Ras and p-ERK1/2 contributes to the arsenic trioxide-induced reduction in drug resistance towards doxorubicin in gastric cancer cell lines[J].Mol Med Rep,2015,12(5):7335-7343.

[7] 刘红春,李莹莹,刘玉含,等.食管鳞癌组织中TPX2 mRNA的表达及与临床病理生物学特征的关系[J].临床与实验病理学杂志,2010,26(2):151-153.

[8] 张春梅,李敏,周仕娴.乳腺癌组织中 TPX2 蛋白的表达及其临床意义[J].临床与实验病理学杂志,2015,31(5):528-531.

[9] 张红香,张云香,李湘洲,等.TPX2和胸苷磷酸化酶在胃癌中的表达及其临床意义[J].国际病理科学与临床杂志,2011,31(6):486-490.

[10] 才保加,祁玉娟,周为,等.结肠腺癌患者癌组织中TPX2、PTEN和Ki67的关系及临床意义[J].中国老年学杂志,2014,34(9):2399-2401.

[11] Chowdhury A,Chowdhury S,Tsai MY.A novel aurora kinase a inhibitor MK-8745 predicts TPX2 as a therapeutic biomarker in non-Hodgkin lymphoma cell lines[J].Leuk Lymphoma,2012,53(3):462-471.

[12] Gao Y,Shi W,Cui J,et al.Design,synthesis and biological evaluation of novel tetrahydroisoquinoline derivatives as P-glycoprotein-mediated multidrug resistance inhibitors [J].Bioorg Med Chem,2018,26(9):2420-2427.

[13] Geng M,Wang L,Chen X,et al.The association between chemosensitivity and Pgp,GST-π and Topo Ⅱ expression in gastric cancer[J].Diagn Pathol,2013,8:198.

[14] Phuthong S,Settheetham-Ishida W,Natphopsuk S,et al.Genetic polymorphism of the Glutathione S-transferase Pi 1(GSTP1)and susceptibility to cervical cancer in human papilloma virus infected northeastern thai women[J].Asian Pac J Cancer Prev,2018,19(2):381-385.

[15] 贾志宇,郭涛,庄志征,等.Bcl-2家族蛋白在莱菔硫烷诱导人涎腺腺样囊性癌细胞系ACC-M凋亡中的作用[J].河北医科大学学报,2016,37(2):161-165.

[16] 王颖欣,李昌英,何胜利.上皮性卵巢癌中Bcl-2/Bax比值与临床病理因素及化疗的关系[J].河北医科大学学报,2015,36(11):1282-1284,1299.

胃癌组织中TPX2与肿瘤细胞铂类药物耐药的关系及意义

1 资料与方法

2 结 果

3 讨 论

Relationship and significance of TPX2 in drug resistance of gastric cancer for platinum chemotherapy drugs

2 结果

3 讨论