重症肌无力(myasthenia gravis,MG)是一种主要由乙酰胆碱受体抗体(anti-acetylcholine receptor,AchR-Ab)介导、针对神经肌肉接头突触后膜上AchR的自身免疫性疾病[1]。而AchR-Ab阴性的MG，目前分析可能存在其他影响神经肌肉接头功能的抗体，如酪氨酸激酶抗体(anti-muscle-specific receptor tyrosine kinase,MuSK-Ab)、低密度脂蛋白受体相关蛋白4抗体(anti-low-density lipoprotein receptor-related protein 4，LRP4-Ab)、抗兰尼碱受体钙释放通道抗体(anti-ryanodine receptor，RyR-Ab)[2-3]等。B淋巴细胞是机体内唯一能够分泌产生免疫抗体的细胞，其在MG的发病过程中的作用至关重要。目前已知CXCL13为B细胞趋化因子，与其受体CXCR5相互作用，可趋化B淋巴细胞的迁移聚集，促进B淋巴细胞分化为浆细胞而产生抗体[4]。故在B淋巴细胞产生抗体的过程中，CXCL13和CXCR5发挥着关键性作用。有研究证实，CXCL13 mRNA在MG患者增生的胸腺组织中呈现出高表达[5-6]。CXCL13 mRNA在MG伴胸腺瘤患者中的表达明显高于单纯胸腺瘤组[6]。推测在MG伴胸腺瘤患者中，CXCL13具有重要意义。而对于CXCR5在胸腺及胸腺瘤组织中的表达鲜见相关研究报道。本研究通过检测MG伴胸腺瘤患者胸腺瘤组织中及瘤旁组织中CXCL13和CXCR5的表达水平，验证CXCL13和CXCR5在MG伴胸腺瘤发病过程中的作用，旨在进一步探讨胸腺瘤诱发MG发病的机制。
1 资料与方法
1.1 一般资料 收集2012年2月—2017年2月河北省石家庄市第一医院患者组织标本，根据疾病类型分为：30例MG伴胸腺瘤的胸腺瘤组织及瘤旁组织标本，男性12例，女性18例，年龄27～74岁，平均(48.53±12.89)岁；40例MG伴胸腺增生的胸腺组织标本，男性14例，女性26例，年龄24～61岁，平均(45.65±10.11)岁；24例接受心脏病手术患者正常胸腺组织标本，男性8例，女性16例，年龄39～55岁，平均(45.75±5.83)岁。3组性别、年龄差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。
1.2 诊断标准 MG诊断标准：①临床表现为眼睑下垂、复视、斜视、四肢无力、吞咽咀嚼困难、呼吸困难等；②新斯的明试验阳性；③AchR-Ab阳性；④肌电图提示重频电刺激低频衰减、高频无递增[7]。符合4项中任意2项即可诊断。胸腺瘤诊断标准：胸腺瘤切除术后病理检查明确胸腺瘤诊断，根据WHO胸腺肿瘤国际组织学分类标准分为5型，即A、AB、B1、B2、B3型[8]。
1.3 纳入标准和排除标准 纳入标准：①均明确诊断为MG；②所有组织标本均经病理证实；③年龄24～75岁；④血清AchR-Ab阳性；⑤对照组所有患者各项体检指标正常，无合并其他疾病，且在3个月内未曾使用过免疫抑制剂和(或)激素。排除标准：①就诊前3个月内曾经使用过免疫抑制剂和(或)激素以及患有其他自身免疫性疾病的患者；②MuSK-Ab、LRP4-Ab阳性的MG患者。
1.4 实时荧光定量PCR测定 用液氮于研钵中研磨样本，抽提胸腺组织总RNA。取5 μL RNA用1%琼脂糖凝胶进行电泳，以检测RNA的完整性。用TIANScript RT KIT进行反转录获取组织cDNA片段、PCR扩增目的CXCL13基因片段及CXCR5基因片段。CXCL13 上游引物 P1：5′-GCTCAGTCTTTATCCCTA-3′；下游引物P2:5′-TTCTCAATACTTCCATCA-3′。CXCR5上游引物 P1:5′-GACACGCAGTTCCACGGAGACC-3′；下游引物 P2：5′-ACGGCAAAGGGCAAGATG-AAGA-3′。以β-actin 作为内参照，上游引物 P3：5′-AAGGCCAACCGCGAGAA-3′；下游引物 P4：5′-ATGGGGGAGGGCATACC-3′。PCR 反应条件：95 ℃预变性 15 min，95 ℃变性 10 s，58 ℃退火30 s，72℃延伸30 s，40个循环。应用荧光定量PCR仪，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。
1.5 统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件分析数据。计量资料比较分别采用F检验和SNK-q检验；计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
MG伴胸腺瘤组、MG伴胸腺增生组和瘤旁组织组CXCL13 mRNA和CXCR5 mRNA表达水平均高于正常组，MG伴胸腺瘤组CXCL13 mRNA和CXCR5 mRNA的表达水平又均明显高于MG伴胸腺增生组和瘤旁组织组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。
表1 4组CXCL13 mRNA和CXCR5 mRNA表达比较
组别 例数CXCL13 mRNACXCR5 mRNAMG伴胸腺瘤组 3025.59±15.56∗#△25.77±12.01∗#△MG伴胸腺增生组4011.38±7.93∗12.47±8.32∗瘤旁组织组 308.96±5.74∗8.71±4.86∗正常组 241.00±0.461.13±0.62F值 33.46246.542P值 0.0000.000
*P值<0.05与正常组比较 #P值<0.05与瘤旁组织组比较 △P值<0.05与MG伴胸腺增生组比较(SNK-q检验)
3 讨 论
MG是一种自体免疫抗体介导的神经肌肉接头突触传递障碍的自身免疫性疾病，是由CD4+ T细胞介导的B细胞活化和合成IgG1、IgG3或IgG4亚类的致病性高亲和性的自身抗体所致。这些自身抗体与突触后膜的AchR结合，或与MuSK、LRP4和聚集蛋白结合，造成神经肌肉的传递功能障碍[2]，从而导致MG患者出现骨骼肌异常疲劳、反复运动后加重等临床特征。其中70%～90%的MG患者血清中检测到AchR-Ab，而另外10%～30%的MG患者血清中不能检测出AchR-Ab[9]。
MG是与胸腺密切相关的疾病，MG患者中70%～90%伴有胸腺的异常，如胸腺增生、胸腺瘤等。据报道，MG是胸腺瘤的副肿瘤综合征[10]。有统计表明胸腺瘤患者中有30%～50%伴发有MG[11]，而MG患者中10%～20%为胸腺瘤[1]。胸腺瘤是最常见的前纵隔肿瘤之一，约占成人纵隔肿瘤的20%，其来源于胸腺上皮细胞，表现有独特的临床病理特点，并且伴随多种副肿瘤症状。美国国家癌症研究所调查发现，胸腺瘤的发病率是0.15/10万，男女发病比例无明显差异，其发病高峰年龄为40～50岁。综合其细胞成分及细胞来源的不同，将胸腺瘤分为：A型胸腺瘤，即髓质型或梭型细胞胸腺瘤；AB型胸腺瘤，即混合型胸腺瘤；B型胸腺瘤，按照淋巴细胞比例的增加情况进一步分为B1、B2和B3型；C型胸腺瘤，即胸腺癌，组织学上此型较其他类型的胸腺瘤更具有恶性特征[8]。由于胸腺瘤常伴发MG而得到广泛的关注。通过对胸腺瘤合并MG患者进行胸腺瘤+胸腺切除术前后观察发现，术后MG的临床症状缓解率约为70%，且AchR-Ab几乎表达于所有胸腺瘤合并MG的患者中[12]。因此，推测合并胸腺瘤的MG的发生与胸腺瘤存在密切关系。虽然对于合并胸腺瘤的MG发病机制尚不明确，但就目前血清学检测呈现出的特异性抗体滴度增高的特点，普遍认为这些特异性自身抗体的产生是此病发病机制中的重要因素[2]。而抗体的产生依赖于B淋巴细胞的激活、增殖、分化，故B淋巴细胞免疫效应的产生与MG发病有着密切的关系。
B淋巴细胞是体液免疫的主导细胞，当遇到特异性抗原时，在细胞因子的趋化下，被诱导激活、分化、产生抗体，细胞因子在这个过程中发挥了关键性的调节作用，而趋化因子是这其中重要的部分。1998年发现的趋化因子CXCL13，也称为B细胞趋化因子1或B细胞吸附因子l。其受体CXCR5广泛分布于成熟的B淋巴细胞及部分记忆性辅助T细胞，CXCLl3及其受体CXCR5主要功能为趋化滤泡辅助性T细胞进入淋巴滤泡后形成生发中心，同时趋化B淋巴细胞进入到生发中心，进而诱导B淋巴细胞活化，产生抗体[4]。有研究发现，CXCL13主要由树突状细胞产生，主要分布于人的淋巴结、血清、胃及肝脏中，而唾液腺及乳腺中也有少量分布。但近些年来，有人发现CXCL13及其配体CXCR5在多种肿瘤组织以及自身免疫性疾病中均有异常高表达，甚至发现参与介导肿瘤细胞的增殖[4,13-15]。
有研究表明，MG患者血清中CXCL13表达水平明显高于正常对照组，MG患者增生的胸腺组织中CXCL13 mRNA的表达水平同样增高明显[5]。胸腺瘤伴发MG的患者，其血清中的CXCL13浓度水平显著高于单纯胸腺瘤组及正常对照组，胸腺瘤伴发MG组其胸腺瘤组织中CXCL13 mRNA的表达水平显著高于单纯胸腺瘤组[6]。但截至目前尚鲜见对瘤旁组织的研究及CXCL13、CXCR5在各组织中表达的研究，无法进一步印证胸腺瘤在胸腺瘤伴发MG发病机制中的作用。
本研究结果一方面验证了CXCL13 mRNA在合并MG的增生胸腺组织中及瘤组织中高表达的结论，另一方面也验证了CXCR5 mRNA同样高表达于合并MG的增生胸腺组织中及瘤组织中，且发现合并MG的胸腺瘤组织其CXCL13 mRNA及CXCR5 mRNA表达水平远高于瘤旁组织。CXCL13 mRNA及CXCR5 mRNA在合并MG的增生胸腺组织及瘤组织中异常表达，表明胸腺功能异常在MG发病过程中有可能发挥重要作用，CXCL13及CXCR5过表达，使得过多的淋巴细胞及其相关细胞形成胸腺的生发中心，产生过多的抗体，从而诱发MG的发生。伴发MG的胸腺瘤组织中CXCL13 mRNA及CXCR5 mRNA的表达水平远高于瘤旁组织，推测胸腺瘤是诱发合并胸腺瘤的MG的重要因素，与MG的发生密切相关。然而，导致胸腺组织及瘤组织中CXCL13及CXCR5过表达的原因尚待研究。
目前对于MG的治疗囊括了内科与外科的治疗方式。在内科诊疗中，除了应用胆碱酯酶抑制剂改善肌无力症状外，还包括通过应用糖皮质激素、免疫抑制剂、血浆交换、输注免疫球蛋白等减少体内自身抗体的治疗。而胸腺切除的外科治疗，在一定程度上可以缓解部分患者的肌无力症状，但是其对患者的创伤相对较大，且费用相对较高，对实施治疗的医院条件有一定的要求。围手术期肌无力状态的波动，特别是肌无力危象的发生、呼吸道感染的发生、伤口愈合不良等手术并发症的发生均是难以避免的，这在一定程度上增加了患者的经济负担及心理负担，影响后期恢复。上述应用的各种治疗方式均不能治愈MG，故需要对MG的发病机制进行更深入的探索研究，并寻找更优的治疗方法，以便从根本上治愈MG病。CXCL13或CXCR5有可能成为治疗MG的新靶点。
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