近年来，我国不孕症的发病率逐年升高，据统计其临床发病率达到10%～25%[1]。不孕症的病因较为复杂，受遗传、感染、免疫和内分泌等多种因素的影响，目前对于不孕症的原因和发病机制尚缺乏统一的认识。研究发现，女性糖尿病患者受孕率仅为2%～5%，且常伴有异常子宫出血、不孕，或妊娠后发生早产、死胎等。因此，糖尿病的早期诊断、早期干预，能够降低不孕症的发生率[2] 。在不孕的病因中，子宫内膜容受性差，即子宫对胚胎的定位、黏附、侵入子宫内膜的接受能力低，是直接导致胚胎反复植入失败的原因[3]。通过检索中国科学引文数据库，2006～2017年的121项研究表明，中药治疗能显著改善子宫内膜窗口期的容受性，促进子宫内膜雌激素受体、孕激素受体、整合素β3及白细胞抑制因子(leukemia inhibitory factor，LIF)等的表达，从而改善子宫内膜容受性和增加胚胎植入率[4]。姜黄素是从植物姜黄中提取出来的一种主要的活性单体，呈黄色，是一种酸性低酚类物质，具有抗炎、降低血糖、改善胰岛素抵抗及调节免疫等作用[5]。LIF是 IL-6 家族的多效分泌细胞因子，有促进细胞增殖和抑制分化的作用[6]。LIF作为子宫内膜容受性的主要标志物之一，其主要作用于胚胎发育过程中及胚泡着床过程中，是判断胚泡能否着床、内膜是否对胚泡有接受性的重要指标。整合素β3是目前公认的与子宫内膜容受性关系密切的一种细胞黏附分子，在蜕膜及子宫内膜、绒毛膜外细胞滋养层中表达，参与细胞间和细胞外基质成分的黏附，利于胚胎着床[7]。本研究利用链脲佐菌素在雌性大鼠中构建2型糖尿病大鼠模型，观察姜黄素治疗后对雌性大鼠子宫内膜整合素β3 和LIF的表达水平的影响，探讨其对糖尿病患者子宫内膜容受性的改善作用，旨在为临床用药提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物 健康清洁级雌性大鼠40只和20只雄性大鼠，体重160～220 g(由河北省实验动物中心提供)。在40只雌性大鼠中，随机挑选10只给予普通饲料喂养作为正常组，另30只给予高脂高糖饲料喂养，饲料配方： 维持饲料(66.5%)+蔗糖(20%)+猪油(10%)+胆固醇(2.5%)+胆酸钠(1%)。6 周后给予 1% 链脲佐菌素， 按照 30 mg/kg的剂量给予腹腔注射，注射 1 周后开始监测血糖，连续监测 4周，以随机血糖≥16.7 mmol/L的大鼠为2型糖尿病模型，从成模组中随机挑选20只。
1.2 动物的分组及给药 2型糖尿病大鼠模型20只大鼠随机分成 2 组，糖尿病组10只、姜黄素治疗组10 只。姜黄素治疗组灌胃给药(同一时间，1次/d)，同时正常组和糖尿病模型组雌性大鼠继续给予食用玉米油2.5 mL/kg高脂高糖饲料喂养，3组共同喂养10周。20只雄性大鼠正常喂养。
1.3 动物合笼 10周后，按雌雄比例3∶2合笼，次日晨查雌鼠阴道，发现阴栓者计为妊娠第 1 天，雌性大鼠均于妊娠第 4 天取材。
1.4 实验试剂和仪器 浓缩型兔抗鼠整合素β3抗体购于Bioworld Technology 公司，兔抗鼠 LIF抗体购于Origene公司，食用玉米油选用西王玉米胚芽油。姜黄素化合物在降脂通络软胶囊(神威药业提供)中提取，其提取物中含姜黄素化合物的浓度为(55.26±1.81)%。姜黄素化合物混悬液配制方法：将 17.5 g降脂通络软胶囊溶于 100 mL 玉米油中，配制成终浓度为100 mg/mL 的姜黄素混悬液，灌胃的剂量每天250 mg/kg。 仪器选用奥林巴斯BX53研究型生物显微镜、全自动化学发光仪等。
1.5 实验方法
1.5.1 血糖及胰岛素测定 2%戊巴比妥钠麻醉大鼠后，于下腔静脉取血，血液在4 ℃低温冷藏箱中放置1 h，后在3 500 r/min离心10 min，取上清液，应用全自动生化分析仪(Cobas 8000)检测大鼠空腹血糖，应用全自动免疫分析仪(德国Bayer公司)以化学发光法检测大鼠血清中的空腹胰岛素水平。
1.5.2 普通光镜、免疫组织化学切片制备 将动物麻醉后迅速剥离子宫组织固定于4%多聚甲醛溶液中，24 h后经常规梯度酒精脱水，二甲苯透明后石蜡包埋机包埋。轮转式切片机连续切片，厚度约为6 μm，取3片蜡带分别裱于涂有蛋白甘油(用于普通HE染色)及多聚赖氨酸(用于整合素β3、 LIF免疫组织化学染色)的载玻片上。常规HE染色，用SP法进行免疫组织化学染色，阴性对照用PBS代替一抗。
1.5.3 Western blot分析 将动物麻醉后迅速剥离刮取子宫内膜装入EP管中，置于-80 ℃冰箱中保存。组织加入 RIPA 裂解液、PMSF与蛋白酶抑制剂混合物的混合液，50 μL/100 mg 组织，提取总蛋白。 BCA法测定蛋白浓度。10%SDS-PAGE胶电泳分离蛋白。5%脱脂奶粉封闭PVDF膜3 h，分别加入一抗兔抗鼠整合素β3、LIF抗体(1∶2 000)4 ℃过夜孵育，室温TBST漂洗PVDF膜3次，每次10 min，加入二抗羊抗兔IgG HRP(1∶2 000)37 ℃ 1 h，漂洗PVDF膜，使用Tanon 5500全自动化学发光图像分析系统扫描PVDF膜成像后以各组目的蛋白条带光密度值与内参蛋白β-actin光密度值计算相对比值作为各组蛋白表达量。
1.6 统计学方法 应用 SPSS 13.0 统计软件包分析数据。计量资料比较分别采用F检验和SNK-q检验。P<0.05为有差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 各组大鼠血糖、胰岛素、LIF和整素β3水平比较 糖尿病组空腹血糖和空腹胰岛素均较正常组明显升高(P<0.05)；糖尿病组LIF和整合素β3均较正常组明显降低(P<0.05)，姜黄素治疗组LIF和整合素β3水平均较糖尿病组明显降低，但仍高于正常组(P<0.05)，Western blot实验也显示了同样的结果。见图1，表1。
图1 各组大鼠整合素β3和ILF 的蛋白表达
Figure 1 Protein expression results of integrin β3 and ILF in among groups
表1 各组大鼠血糖、胰岛素、LIF和整合素β3水平比较
Table 1 Comparison of glucose,insulin，ILF and integrin β3 levels among groups
组别 空腹血糖(mmol/L)空腹胰岛素(mU/L)LIF(OD值)整合素β3(OD值)正常组 8.89±0.9813.31±2.312.134±0.2311.775±0.110糖尿病组 27.15±1.87∗32.39±2.95∗0.950±0.202∗1.049±0.158∗姜黄素治疗组16.93±2.05∗#19.24±2.30∗#1.712±0.140∗#1.642±0.262#F值 3642.2572167.15138.99918.511P值 0.0000.0000.0000.000
*P值<0.05与正常组比较 #P值<0.05与糖尿病组比较(SNK-q检验)
2.2 HE染色观察子宫内膜形态学变化 正常组子宫内膜上皮细胞排列整齐，细胞核呈椭圆形，位于基底部，胞质丰富，强嗜酸性，染色呈深红色，上皮细胞向固有层内凹陷形成子宫腺，腺上皮与子宫表面上皮相似排列整齐，固有层血管丰富，并含有大量的梭形或星形的基底细胞；糖尿病组子宫内膜上皮细胞收缩呈矮柱状，细胞核内异染色质多且形状不规则，胞质出现空泡，弱嗜酸性，固有层内可见少量的炎性细胞，腺体数量增加，某些腺体扩张成囊状；姜黄素治疗组子宫内膜上皮细胞排列较整齐，细胞核呈椭圆形，胞浆较丰富，弱嗜酸性，腺上皮与子宫表面上皮相似，固有层结构也与正常组相似。见图2。
图2 各组大鼠的子宫内膜结构(HE染色 ×200)
A.正常组；B.糖尿病组；C.姜黄素治疗组
Figure 2 Endometrial structure among groups(HE staining ×200)
2.3 免疫组织化学染色观察整合素β3和ILF 的蛋白表达 正常组LIF主要在子宫内膜上皮细胞的胞浆内呈顶浆分泌状表达，阳性颗粒呈棕黄色，子宫内膜上皮细胞可见棕黄色物质形成，腺上皮细胞也有少量表达；糖尿病组子宫内膜上皮细胞及腺腔上皮细胞内均可见少量LIF阳性颗粒表达；姜黄素治疗组子宫内膜上皮细胞胞浆内的阳性颗粒明显增多，接近正常组的表达量。见图3。
图3 各组大鼠子宫内膜LIF表达(免疫组织化学染色 ×400)
A.正常组；B.糖尿病组；C.姜黄素治疗组
Figure 3 Expression of LIF in endometrium among groups(immunohistochemical staining ×400)
正常组整合素β3主要在子宫内膜上皮细胞的胞浆内均匀表达，阳性颗粒呈棕黄色，腺上皮细胞内也可见棕黄色物质形成；糖尿病组子宫内膜上皮细胞及腺上皮细胞内表达量明显减少；姜黄素治疗组子宫内膜上皮细胞胞浆内的阳性颗粒与糖尿病组相比明显增加。见图4。
图4 各组大鼠子宫内膜整合素β3表达(免疫组织化学染色 ×400)
A.正常组；B.糖尿病组；C.姜黄素治疗组
Figure 4 Expression of integrin β3 in endometrium among groups(immunohistochemical staining ×400)
3 讨 论
子宫内膜容受性是指子宫内膜接受胚胎的能力。据统计，在自然周期中，胚胎的种植率约为30%。以前的临床研究已经证实，2型糖尿病可对女性患者的生殖功能造成损伤[8]，但对糖尿病与超重女性的胚胎种植率关系很少有研究统计。因而，探索改善糖尿病女性患者子宫内膜容受性的方法，减少子宫内膜血供的损伤，保护子宫的正常功能，对指导临床干预及用药具有重要意义。
在胚胎植入的过程中，良好的子宫内膜的容受性是胚胎能否成功着床的关键。子宫内膜容受性与多种因素有关，如患者基础内分泌紊乱、细胞因子和黏附分子异常等。而糖尿病会造成一系列的内分泌功能紊乱，如高胰岛素血症、胰岛素抵抗等，从而导致不孕症的发生。因此，对于生育功能异常的糖尿病患者，降低血糖、改善胰岛素抵抗是改善子宫内膜容受性的有效治疗途径。近年来，中药改善子宫内膜容受性已取得较好的效果，如抑抗汤可提高细胞的黏附功能，增加子宫内膜的LIF 水平和整合素β3的表达，从而改善子宫内膜容受性[9]；右归丸可通过改善子宫动静脉循环，增加子宫内膜厚度，从而改善子宫内膜的容受性[10]；近期的研究也表明疏肝补肾法也能够有效改善慢性应激小鼠子宫内膜容受性,从而提高妊娠成功率[11]。
本研究利用链脲佐菌素成功诱导2型糖尿病雌性大鼠模型，结果显示，与对照组相比，糖尿病模型组血糖及胰岛素水平均明显升高，而子宫内膜容受性指标整合素β3和LIF表达显著下降，提示糖尿病大鼠已出现明显的血糖调节紊乱及子宫内膜功能的下降；相对于糖尿病模型组，姜黄素治疗组血糖和胰岛素水平明显改善，而子宫内膜整合素β3和LIF显著升高。既往研究表明姜黄素具有肥胖症和胰岛素抵抗的免疫调节作用，可降低糖基化血红蛋白和血糖的整体水平；使用姜黄素或胰岛素进行单独治疗，可降低血糖、血脂异常和肝肾损伤的生物标志物，并增强肝脏抗氧化剂(超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶)的活性[12]。 推测姜黄素可能通过降低血糖、改善胰岛素抵抗、改善脂质代谢紊乱和微循环，最终改善子宫内膜容受性，进而提高妊娠率。
LIF是近年来国内外生殖领域的研究热点，其主要功能是维持胚胎干细胞的未分化状态[13]。LIF作为分泌型糖蛋白，具有广泛的生物学功能。它在月经周期的19～25 d内分泌最多，与子宫内膜植入窗口期重叠，故也可作为子宫内膜容受性的重要指标。在生殖系统中，LIF主要在子宫内膜腺体细胞中表达，其主要作用在植入的黏附和侵入阶段。研究发现，LIF通过控制人类白细胞抗原G抗原的表达实现对滋养层细胞侵袭性的调控。LIF基因敲除实验中发现，LIF基因缺陷的纯合雌鼠虽能正常排卵和受精，受精卵可正常发育，但在种植窗期间，胚胎无法着床，游离于宫腔内，子宫内膜也不发生蜕膜反应。LIF是子宫内膜容受性中的主要和有效分子之一，充当雌激素的下游介质，故在胚泡植入的过程中起关键作用。
Zhao等[14]对160例自然流产患者给予寿胎丸治疗，统计分析其子宫内膜厚度、形态及治疗前后子宫内膜LIF表达水平，发现治疗后子宫内膜厚度、LIF表达水平等均有显著改善。本研究结果显示，姜黄素治疗组的子宫内膜中，LIF阳性表达在腔上皮和腺体中的细胞浆内，并呈顶浆分泌状，腺腔内也可见棕黄色物质形成，腔上皮表达较腺体强；姜黄素治疗后的子宫内膜的LIF表达量较糖尿病组增高。表明姜黄素治疗可以改善子宫内膜容受性。
整合素β3在子宫内膜周期的各时期中均有表达。但在着床窗口期，整合素β3的表达显著上调[7]。整合素β3参与子宫内膜容受性的调节及胚胎的植入过程，它在“着床窗口期”表达增加显著。其表达减少表示子宫内膜容受性下降。李秀然[15]研究发现整合素β3规律表达于围着床期子宫内膜，在大鼠的妊娠过程中，妊娠第4天整合素β3达到高峰，之后表达又逐渐减弱。表明整合素β3可作为子宫内膜容受性的客观标志。在探讨子宫内膜中整合素β3表达水平与子宫内膜容受性的相关性中，马彩辉等[16]在35例妊娠失败行体外受精-胚胎移植患者中发现，其子宫内膜腔上皮整合素β3表达显著低于正常生育者，认为体外受精-胚胎移植患者的妊娠失败可能与整合素β3表达降低有关。本研究结果显示，姜黄素治疗组的子宫内膜腔上皮、腺体整合素β3表达明显高于糖尿病组。表明整合素β3表达增加可诱导子宫内膜容受性改善。
综上所述，姜黄素可以改善糖尿病患者子宫内膜容受性，此结果具有重要的临床指导意义；但具体机制尚需进一步深入研究。
[1] 魏瑞瑞，安力彬，李晶，等.女性不孕症患者生活质量现状调查及影响因素分析[J].中国妇幼保健，2017，32(6):1262-1265.
[2] 姜海英，李静，杨丽丽，等.妊娠期糖尿病早期对血清Nesfatin-1、IL-6、TNF-α及APN表达水平的影响[J].河北医科大学学报，2018，39(8):934-937.
[3] 耿会转,周忠明,邓亚丽，等.解郁育胞方对慢性应激致大鼠子宫内膜低容受性的机制研究[J].中药药理与临床，2016，32(1):152-156.
[4] Lyu BY,Li D,Zhang HL,et al. Effect and regulation mechanism of Chinese Bushen Huoxue prescriptions on endometrial receptivity[J]. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi，2018，43(10):2014-2019.
[5] 龚淼,李莉,包宪霞，等.姜黄素对体外培养的人食管癌Ec-109细胞增殖和凋亡的影响[J].河北医科大学学报，2012，33(2):125-128.
[6] Aghajanova L,Altmäe S,Bjuresten K,et al. Disturbances in the LIF pathway in the endometrium among women with unexplained infertility[J]. Fertil Steril，2009，91(6):2602-2610.
[7] Lessey BA,Ilesanmi AO,Lessey MA,et al. Luminal and glandular endometrial epithelium express integrins differentially throughout the menstrual cycle:implications for implantation,contraception,and infertility[J]. Am J Reprod Immunol，1996，35(3):195-204.
[8] Catalano PM,Shankar K. Obesity and pregnancy:mechanisms of short term and long term adverse consequences for mother and child[J]. BMJ，2017，356:j1.
[9] 余军辉，应柳青,王珺.抑抗汤对子宫内膜容受性作用的影响[J].现代实用医学，2018，30(8):994-996.
[10] 肖美玲，张汉青.右归丸对肾阳虚型不孕症患者卵泡发育及子宫内膜容受性的影响[J].现代中西医结合杂志，2018，27(26):2902-2904.
[11] 黄紫微.疏肝补肾法对慢性应激模型小鼠子宫内膜容受性的调节及作用研究[D].郑州：河南中医药大学,2017.
[12] Gutierres VO,Assis RP,Arcaro CA,et al. Curcumin improves the effect of a reduced insulin dose on glycemic control and oxidative stress in streptozotocin-diabetic rats[J]. Phytother Res，2019，33(4):976-988.
[13] 李向东，王秀丽.胚胎干细胞自我更新与诱导分化[J].大连医科大学学报，2017，39(5):417-422，432.
[14] Zhao L,Xu Y,Duo X,et al A probe into effect of Shoutai pill on endometrial receptivity[J]. Exp Ther Med，2018，15(4):3765-3768.
[15] 李秀然.助孕增膜方对肾虚胚胎着床障碍小鼠子宫内膜容受性及相关因子时序表达的影响[J].广州中医药大学学报，2018，35(6):1058-1065.
[16] 马彩辉,古少君.体外受精-胚胎移植失败者子宫内膜整合素β3及细胞间隙连接蛋白43的表达研究[J].中国医刊，2018，53(6):623-625.