全世界每年均有数以万计的患者被诊断为“充血性心力衰竭”[1-3]，故缺血性心脏病己成为危害人类健康的最主要疾病。人们普遍认为，成熟的心肌细胞是终末分化细胞，一旦损伤坏死后不能再生，心肌梗死后即使通过临床治疗能够改善心肌缺血的症状，却不能逆转心肌细胞的坏死，最终导致充血性心力衰竭的发生。而成体心脏中的心肌干细胞数量极少，起不到修复的作用，加上心脏移植疗法供体稀缺、免疫源性高和费用昂贵的限制，许多研究者将目光投向干细胞移植治疗技术。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)易于从自体获取；在体外易进行分离、培养扩增和外源性基因加工，具有多向分化潜能[4-8]。因此，BMSCs是组织工程中较为理想的种子细胞。有研究表明，心肌分化的过程始于某个或某些关键基因的启动。其中，GATA-4是非常重要的发育调节因子[9]，也是心肌细胞早期表达的转录因子之一，对心脏形态的发育有十分重要的作用。细胞穿透肽(cell-penetrating protein，CPP)是一种能够通过蛋白质转导的方法穿透细胞膜到达细胞核，并且能够保留其生物学活性的蛋白质。在体内及体外实验中，CPP已成功帮助蛋白质、多肽、DNA 和siRNA 等大分子生物活性物质传递到细胞内，VP22是CPP中的一种。由于CPP不受细胞种类的限制，并且传递效率高，故CPP常用于在不同组织间传递大分子量的生物活性蛋白。由于脂质体转染法缺少靶向作用及低转化率，本研究尝试借助VP22穿透肽的载体作用帮助GATA-4基因瞬时转染至BMSCs中，观察其在诱导剂5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-aza)的作用下向心肌分化的情况， 并与单纯经5-aza诱导后的BMSCs向心肌细胞分化的情况作比较，旨在为BMSCs能够高效转化为心肌细胞提供方法。报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物和材料 健康3周龄SD大鼠，雌雄不限，由河北省实验动物中心提供；pVP22-GATA-4/myc-His质粒由美国Marc Penn博士惠赠。质粒抽提试剂盒(美国Promega公司)，DMEM/F12培养基(美国Gibco公司)，胎牛血清(PAA)，胰蛋白酶(美国Gibco公司)，Lipofectamine 2000(美国invitrogen公司)，5-氮杂胞苷(美国Sigma公司)，兔抗GATA-4单克隆抗体(北京中杉生物公司)，鼠抗心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T，cTnT)单克隆抗体(美国Abcam公司)，鼠抗myc单克隆抗体(北京中杉生物公司)，鼠抗β-action单克隆抗体(Santa Cruz公司)，TEMED(美国Sigma公司)，甘氨酸(索莱宝)。
1.2 pVP22-GATA-4/myc-His质粒的转化和酶切鉴定
1.2.1 制备E.coli DH5α感受态 从LB平板上挑取新活化的E.coli DH5α单菌落，接种于3～5 mL LB液体培养基中，37 ℃下振荡培养12～14 h，直至对数生长后期。将该菌悬液按比例接种于 LB液体培养基中，37 ℃振荡培养。将培养液转入离心管中，冰上放置10 min，使培养液冷却至0 ℃，然后于4 ℃下5 000 g离心10 min。弃上清，用预冷的0.1 mol/L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰上放置15～30 min，4 ℃，5 000 g离心10 min。弃上清，加入预冷含20%甘油的0.1 mol/L CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置数分钟，即成感受态细胞悬液。
1.2.2 pVP22-GATA-4/myc-His的转化及抽提 取120 μL感受态细胞悬液。将有pVP22-GATA-4/myc-His质粒的滤纸剪下，放入预先加入10 μL双蒸水的离心管中，溶解质粒。吸取质粒DNA溶液加入到感受态细胞悬液中，冰上放置30 min。42 ℃水浴中热击90 s，热击后迅速置于冰上冷却3～5 min。向管中加入LB液体培养基(不含Amp)，混匀后37 ℃振荡培养45 min，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒所编码的抗生素抗性基因。将上述菌液混匀后涂布于含Amp的筛选固体培养基上，37 ℃倒置培养。从LB平板上挑取转化的单克隆菌落，接种于含Amp的LB液体培养基中，37 ℃下振荡培养，取800 μL菌液加入200 μL高压过甘油，混匀，-70 ℃保存。质粒的抽提步骤参见美国Promega公司质粒小提试剂盒。
1.2.3 pVP22-GATA-4/myc-His酶切鉴定 混匀酶切反应体系后，37 ℃水浴保温3～4 h，使酶切反应完全。1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪观察并照相。
1.3 大鼠BMSCs的分离、培养 取3周龄SD大鼠，雌雄不限，颈椎脱臼法处死后，无菌条件下剥离肱骨、股骨和胫骨，置于含有双抗(青霉素100 μg/mL,链霉素 100 mg/mL)的缓冲液中。显露骨髓腔，用DMEM/F12培养液反复冲洗骨髓腔，冲洗得到的悬液过滤后离心91 g，5 min，弃上清，用含10%胎牛血清的完全培养基重悬细胞，制成单细胞悬液，调整细胞密度为2×106/mL接种于培养瓶中，置于37 ℃，5%CO2的饱和湿度恒温培养箱中培养，48 h后首次换液，以后2～3 d换液1次。贴壁细胞接近80%汇合时以1∶2比例传代。倒置显微镜下观察细胞生长情况和形态变化，选取生长状态良好的第3代细胞进行后续实验。
1.4 大鼠BMSCs过表达GATA-4基因及其表达的鉴定
1.4.1 外源性GATA-4基因瞬时转染大鼠BMSCs 取第3代BMSCs，转染前1 d，更换为不含抗生素的DMEM/F12培养基培养，次日进行转染。将pVP22-GATA-4/myc-His质粒DNA和转染试剂Lipofectamine 2000分别用无血清的培养基稀释，混匀，室温孵育5 min。之后再将两者以最佳转染体系比例混匀，室温孵育20 min后置于细胞表面，摇匀，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。4～6 h后更换为无抗生素的10%胎牛血清DMEM/12培养基中培养48 h，使细胞表达外源基因。转染实验至少独立重复3次。
1.4.2 免疫印记法检测外源性GATA-4的表达 转染后2 d收集细胞，加入蛋白裂解液提取细胞总蛋白。应用微量紫外光度计进行蛋白定量。取适量样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法电泳，将电泳后的蛋白转移至聚偏氟乙烯膜上，37 ℃脱脂奶粉中孵育2 h，加入一抗GATA-4抗体(1∶1 000)、myc抗体(1∶1 000)、内参抗体β-actin(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜。辣根过氧化物酶标记的羊抗兔或羊抗鼠IgG(1∶10 000稀释)，37 ℃孵育2 h。增强型化学发光试剂显色，在化学发光仪中曝光、显影、摄片。
1.5 5-aza体外诱导BMSCs分化及其鉴定
1.5.1 分组及各组的处理 将生长状态良好的第3代BMSCs随机分为空质粒组、对照组、实验组。空质粒组：瞬时转染PcDNA3.1质粒的第3代BMSCs。对照组：用终浓度为10 μmol/L的5-aza(1 mL培养基中加入10 μL的1 mmol/L 5-aza储存液)诱导第3代BMSCs，诱导时间为1 d。实验组：第3代BMSCs瞬时转染GATA-4:VP22，3 d后向细胞内加入终浓度为10 μmol/L的5-aza作用1 d。5-aza作用1 d后用0.01 mmol/L PBS冲洗2遍，更换为不含5-aza的10%完全培养基继续培养21 d。
1.5.2 免疫细胞化学法检测BMSCs内心肌分化标志物的表达 取实验组和对照组细胞于5-aza诱导后21 d进行免疫细胞化学检测BMSCs向心肌分化的情况。空质粒组细胞于转染后的21 d检测。取3组细胞爬片固定后用SP法分别检测GATA-4和cTnT的表达。阴性对照用PBS替代一抗。显微镜下观察、摄片。
1.5.3 免疫印记法检测BMSCs内心肌分化标志物的表达 提取实验组、对照组5-aza诱导后21 d的细胞总蛋白，及空质粒组转染后21 d的细胞总蛋白，用免疫印迹法检测GATA-4、cTnT的表达，步骤同“1.5.2”项。
1.6 统计学方法 应用SPSS 13.0统计软件分析数据。计量资料比较采用两独立样本的t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 pVP22-GATA-4/myc-His酶切鉴定结果 pVP22-GATA-4/myc-His质粒经过转化、扩增、提取后，用限制性内切酶XbaI、EcoRI进行双酶切鉴定，可以得到约7 500 bp(未经酶切的质粒)和1 300 bp(经酶切后的目的基因片段)2条条带，与质粒构建图一致。与小鼠GATA-4基因编码框(1 325 bp)大小一致。说明pVP22-GATA-4-/myc-His质粒中确实含有小鼠GATA-4基因的编码框。
2.2 大鼠BMSCs体外分离、培养 接种后的BMSCs呈圆形，折光性较强，72 h后，80%细胞已经贴壁，贴壁后的细胞逐渐伸展呈多角形、纺锤形。7～14 d后，80%以上的BMSCs汇合成片，呈旋涡状排列，此时可进行传代。传代后的细胞形态与原代细胞相似，排列呈一定方向性，梭形细胞比例逐渐增多5 d即可继续传代。第3代BMSCs形态基本单一，细胞呈梭形，呈漩涡状排列(图1)。第5代以后的细胞形态变扁平，细胞的增殖能力减弱，且成脂分化的细胞数增多。
2.3 过表达GATA-4基因的BMSCs的表达鉴定 脂质体法转染外源性基因GATA-4后，可见部分细胞死亡，48 h达高峰，之后细胞逐渐恢复状态并开始增殖，转染后72 h，可达到80%～90%汇合生长。
转染后2 d收集细胞，提取贴壁生长细胞的总蛋白，免疫印迹法检测结果显示，VP22-GATA-4和myc蛋白均有表达，证明pVP22-GATA-4/myc-His质粒成功地瞬时转染入BMSCs。空质粒组与对照组均无阳性结果。
2.4 体外5-aza诱导大鼠BMSCs分化及其鉴定 实验组与对照组BMSCs在诱导后初期形态呈现短梭状，后逐渐变长变宽，部分细胞呈长条状，细胞增殖速度变缓慢，细胞体积开始变大，呈短棒状、 多角样和球样(图2)，细胞核增大呈圆形或椭圆形，细胞排列开始出现一定方向性，21 d时细胞排列方向趋于一致，部分细胞自发形成细胞簇。但2组在培养过程中均未发现跳动。
免疫细胞化学结果显示，实验组和对照组在5-aza诱导后的21 d有cTnT(细胞质阳性表达)和GATA-4(细胞核阳性表达)表达(图3)；免疫印迹结果显示，实验组和对照组在5-aza诱导后的21 d有cTnT和GATA-4表达。21 d时，实验组cTnT和GATA-4的表达量均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1,2。空质粒组没有阳性结果。
图1 第3代大鼠的骨髓间充质干细胞(×100)Figure 1 The third generation of BMSCs (×100)图2 实验组BMSCs经5-aza诱导21 d后形态(×400)Figure 2 Morphology of BMSCs in experimental group induced by 5-aza for 21 days(×400)图3 5-aza诱导后21 d免疫细胞化学法检测cTnT和GATA-4阳性表达(免疫细胞化学染色 ×200)A.对照组cTnT阳性表达;B.实验组cTnT阳性表达;C.对照组GATA-4阳性表达;D.实验组GATA-4阳性表达。
Figure 3 Detection of cTnT and GATA-4 positive expression by immunocytochemistry 21 days after 5-aza induction(Immunocytochemical Staining×200)
表1 免疫细胞化学法检测实验组和对照组细胞cTnT、GATA-4的表达
Table 1 Immunocytochemical detection of cTnT and GATA-4 expression in experimental and control cells
组别cTnTGATA-4对照组0.15±0.050.29±0.06实验组0.57±0.020.61±0.07t值15.8037.930P值0.000 0.000
表2 免疫印记法检测实验组和对照组细胞cTnT、GATA-4的表达
Table 2 Detection of cTnT and GATA-4 expression in experimental and control cells by immunoblotting
组别cTnTGATA-4对照组1.91±0.042.30±0.106实验组2.60±0.052.70±0.06t值22.4917.343P值0.0000.000
3 讨 论
在所有成体干细胞中，BMSCs具备以下优点：易于从自体获取，回植后不发生免疫排斥反应；易于在体外进行分离、培养和扩增，并可长时间在体外保持未分化状态；具有很强的多向分化潜能，其在不同环境条件刺激下可向多种中胚层来源的细胞或某些外胚层来源的细胞分化；外源性基因转染效率较高[4-9]，缺少表面标记，终生保持未分化或低分化特征；所处微环境可以影响其分化的方向；通过对称性或非对称性2种分裂方式生长，绝大多数细胞处于G0 期 。因此，BMSCs是组织工程中较为理想的种子细胞。本研究通过全骨髓分离法得到的BMSCs细胞活性较好，经过2次传代纯化后，第3代BMSCs纯度较高，可以满足实验要求。
GATA-4是维持心血管系统发育关键性的转录因子,对心脏形态的发育有十分重要的作用。GATA-4可影响胚胎时期心肌细胞的发育, 缺失GATA-4基因会导致胚胎期腹管及腹部生长、发育异常，胚胎将在受精卵形成早期死亡。 GATA-4和GATA-6完全缺失的胚胎会形成无心畸形。采用特异性基因敲除技术将GATA-4蛋白表达量降低65%～83%，小鼠生存能力降低，发生渐进性心腔增大，心功能指数降低。当经受外界大量负荷刺激时，心脏缺乏代偿能力而发生急性心力衰竭。因此， GATA-4是心脏基因表达、心肌生长发育的关键性调节因子，其缺失或突变可引起心血管系统发育异常，导致先天性心脏病发生。GATA-4还能够阻止药物诱导的心肌细胞凋亡并降低药物引起的心肌毒性，故GATA-4对心肌细胞的正常存活也有一定的作用[10-12]。
CPP也称为蛋白质转导域 (protein translocation domain, PTD)，是一种能够通过细胞磷脂双分子层的小于 30 个氨基酸的短肽。CPP 可以携带大分子生物活性物质，穿透细胞膜进行细胞内传输，也可以通过连接易位的方式将蛋白质或肽转入细胞内，并且毒性低，不会产生细胞膜损伤[13-14]。CPP的这一特性使其成为一种有效的运输载体。实验表明，CPP可以携带多种物质，包括蛋白质、多肽、DNA、siRNA,甚至对颗粒性物质等进行传输，并且不受细胞类型的限制，VP22即为其中的一种。CPP的作用机制可能为：CPP拥有强大的阳离子特性(这是CPP必备的特征)，使其对富含阴离子的细胞膜及核苷酸有强大的黏附作用，使其穿透细胞膜并凝集在细胞核中[15]。由于脂质体转染法缺少靶向作用及低转染率，尝试借助CPP中的VP22穿透肽载体作用促进外源性基因GATA-4瞬时转染至BMSCs中去。本研究结果显示，过表达GATA-4的BMSCs与未转染的BMSCs相比，在生物学特性等方面没有明显变化，表明过表达的外源基因GATA-4 mRNA对宿主细胞的形态和生物学特性不产生明显影响，可以满足实验研究的需要。在转染2 d后免疫印迹法检测结果显示,有外源基因VP22-GATA-4的表达，表明pVP22-GATA-4/myc-His质粒能够瞬时转染入BMSCs。
5-aza因可以诱导大鼠BMSCs向心肌细胞分化而备受关注[16]。5-aza可以诱导BMSCs出现肌管样结构，表达心肌特异性基因,如α-cardiac actin、ANP、NKX2-5等。本研究对照组(5-aza诱导的BMSCs)和实验组(5-aza诱导过表达GATA-4的BMSCs)的免疫细胞化学、免疫印迹结果表明,在诱导后21 d均有cTnT和GATA-4蛋白表达，实验组cTnT和GATA-4蛋白的表达量均高于对照组，差异有统计学意义。说明在5-aza诱导条件下，过表达GATA-4基因能够促进BMSCs向心肌细胞分化。进一步研究BMSCs心肌分化中的信号通路和GATA-4之间的精确调控关系，将有利于提高干细胞向心肌细胞分化的转化效率。
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