丰富环境通过ERK1/2信号通路促进脑缺血后神经功能恢复

神经功能障碍是脑卒中严重并发症之一[1-2]，急性期若不及时诊治可造成严重后果，甚至危及生命。新生神经干细胞存活能力有限，如何促进神经元有效新生，重塑脑卒中后受损的神经功能成为临床亟待解决的问题。丰富环境[3](enriched environment,EE)是一种啮齿类动物康复的模型，其主要特征是“社交性刺激联合非生物性刺激”，特点是空间大，喂养动物多，动物之间可以进行复杂的社会交往。在EE中常设置玩具、小房子、隧道和垫料等，通过定期调整和重设内设物，动物可以在EE中获得更高的记忆和学习能力。 EE环境可以通过神经发生、突触发生、脑血管再生等神经重塑作用促进脑缺血后神经功能的恢复[4]。但是迄今为止，关于EE对神经功能康复的具体作用机制依然未阐明。研究表明，ERK1/2信号通路在脑缺血后神经元氧化损伤中发挥关键作用[5]，激活胶质细胞ERK1/2通路可以促进释放大量炎性介质，进而对神经元造成损伤。相反，抑制ERK1/2通路可以明显减轻脑外伤大鼠脑水肿体积和促进运动功能的恢复[6]。基于上述研究成果，本研究首先建立大鼠大脑中动脉脑缺血模型，观察EE环境对大鼠神经功能的恢复效果，并从ERK通路角度分析其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物来源与分组 60只健康雄性Sprague-Dawley大鼠，体重250～280 g，购自中英合资上海西普尔—必凯实验动物有限公司[动物许可证号：SYXK(沪)2013-0058]。大鼠分笼饲养，自由进食饮水，维持室温(20±2) ℃，昼夜循环光照(光照时间为08:00～20:00)，适应性喂养1周后开始实验。60只大鼠随机分为3组：脑缺血后EE饲养组(Ischemia & EE组)、脑缺血后标准饲养组(Ischemia & SC组)、假手术后标准饲养组(Sham & SC组)，每组20只。实验大鼠的使用按照科技部《关于善待实验动物的指导性意见》[7]相关要求。

1.2 实验试剂与仪器戊巴比妥钠(上海新亚药业有限公司)，RIPA裂解液(武汉博士德生物工程有限公司)，BCA蛋白定量试剂盒(Thermo Fisher公司)，ERK1/2、p-ERK1/2抗体(美国Cell Signaling公司)，GAPDH抗体、辣根过氧化酶标记的二抗(日本TaRaKa公司)。ABL505型电解质与血气分析仪(丹麦Radiometer公司)，CM120型透射电子显微镜(飞利浦公司)。

1.3.1 大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型的建立采用线栓法制备大鼠大脑中动脉栓塞模型，实验操作参考Jeon等[8]报道方法：大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠(60 mg/kg)，待大鼠麻醉后以仰卧位固定于动物手术台，肛温探头测定大鼠肛温(整个手术过程中维持大鼠体温为37 ℃左右)。取肩中连线以上正中切口，血管钳分离甲状腺连接部，钝性分离二腹肌、胸锁乳突肌和肩脾舌骨肌的肌间隙，暴露左侧颈总动脉，用4-0的手术线结扎颈外动脉远心端和颈总动脉近心端，并用手术线紧拉颈内动脉使与颈总动脉成一条直线，脑缺血90 min后抽出栓线恢复灌注，术后逐层缝合。大鼠麻醉苏醒后采用Longa评分法进行评价：0级，无功能障碍；1级，不能伸展左侧前肢；2级，向左侧旋转；3级，向左侧倾倒；4级，无自主活动伴意识抑制；5级，死亡。评分1～3级作为模型建立成功的标准。Ischemia & EE组、Ischemia & SC组大鼠均建立MCAO模型，Sham & SC组仅暴露颈总动脉，然后逐层缝合，不结扎血管。

1.3.2 术后饲养环境 EE环境：自制大木箱(80 cm宽×120 cm长×100 cm高)，每箱饲养10～12只动物，箱内放置各种形状的玩具，如攀爬架、塑料管道、铁链、铃铛、小盒子、滚轮等，每3 d更换1次玩具。标准环境：普通标准铁笼(30 cm宽×40 cm长×20 cm高)，不含任何玩具，每箱饲养3～4只动物。EE环境和标准环境均维持室温(20±2) ℃，昼夜循环光照，自由进食饮水，定期换笼。Ischemia & EE组大鼠术后置于EE环境饲养，Ischemia & SC组和Sham & SC组大鼠于标准环境饲养。

1.4.1 记录生理参数分别于手术前1 d和术后第1天应用电解质与血气分析仪测量大鼠生理参数，包括pH值、二氧化碳分压、氧分压。

1.4.2 行为学评价共设置6个时间点：术前(手术前2 d)及术后第3天、第5天、第7天、第14天、第21天。每次实验大鼠共测试3次，取平均值，行为学评价包括以下项目：①跑梯实验：目的是评价感觉运动功能的缺陷和恢复，术前连续3 d训练大鼠穿越梯子；实验时大鼠沿水平梯子(间距不等)到达终点，随时改变横撑，在侧面放置摄像机拍摄动物完成情况和爪的活动情况；根据大鼠行走时错误率进行评分。②前肢放置实验：目的是反映脑出血神经损伤后运动和感觉功能障碍，测试者抓住大鼠背部皮肤，使大鼠四肢悬空，距离实验桌边缘约0.5 cm的位置用刷子轻轻刷过各侧胡须；未受损大鼠会立即将前爪放置桌面，神经功能损伤大鼠会出现动作完成失败；大鼠每侧测试10次，前爪触及桌面次数的百分比即为该侧得分。③前肢不对称实验：目的是评价患肢受伤程度和术后恢复情况，建立一个玻璃圆筒(20 cm直径×30 cm高)，圆筒后放置两面镜子，其夹角为90 °(保证即使大鼠将摄像机打翻也可以继续摄像)，观察大鼠在圆筒5 min运动情况，记录大鼠站立时肢体首次触及圆筒壁的次数和每侧肢体在圆筒壁水平和垂直方向的运动情况。④前爪伸曲实验：目的是利用患肢获取食物所完成的动作评价患肢的康复情况，建立一个树脂玻璃盒(30 cm长×30 cm宽×30 cm高)，盒子一侧放置一个梯子，梯子上有6个台阶，每级台阶上放8个鼠粮(45 mg)作为食饵，术前2周每天训练实验大鼠利用前爪获取台阶上的食物，每次训练20 min。实验前，大鼠禁食24 h，再将大鼠置于平台上，记录20 min内大鼠前爪获取的食物数量。

1.4.3 星形胶质细胞形态学观察术后第21天(完成所有行为学实验后)，大鼠麻醉处死，打开双侧颅骨，完整切除缺血半暗带皮质组织。样本组织分为两部分，一部分用于细胞形态学观察，另外一部分用于后续Western blotting。将其中一部分缺血半暗带皮质组织制成1 mm左右的小块，2.5%戊二醛固定12 h；PBS冲洗3遍，1%四氧化锇固定1 h，纯化水冲洗，梯度乙醇脱水，树脂包埋，经醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色，透射电镜下观察胶质细胞超微结构病理改变。

1.4.4 Western blotting 取另外一部分缺血半暗带皮质组织，手术剪剪碎，加入1 mL RIPA裂解液，充分研磨至匀浆，冰浴上静置30 min，4 ℃低速离心10 min，吸取上清液，BCA蛋白定量试剂盒定量。取40 μg总蛋白SDS-PAGE电泳分离，电泳后转至PVDF膜，5%脱脂奶粉孵育1.5 h；加入t-ERK1/2抗体(1∶500稀释)、p-ERK1/2抗体(1∶500稀释)和GAPDH抗体(1∶1 000稀释)，4 ℃孵育过夜。次日加入辣根过氧化酶标记的二抗(1∶10 000)孵育1 h，Image J软件和定量蛋白灰度值。目的蛋白相对表达量用目的蛋白与GAPDH灰度值表示。

1.5 统计学方法应用SPSS 19.0统计软件处理数据。计量资料比较分别采用F检验、SNK-q检验及重复测量的方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 模型建立前后大鼠生理参数变化 Ischemia & EE组MCAO大鼠模型制备成功16只，Ischemia & SC组成功制备18只，Sham & SC组模型全部存活。各组大鼠建模前、建模后以及建模前后pH、二氧化碳分压、氧分压差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.2 各组MCAO前后大鼠行为学评分比较 Ischemia & EE组和Ischemia & SC组术后3 d跑梯实验、前肢放置实验、前肢不对称实验和前爪伸曲实验错误评分明显上升，术后5～21 d逐渐下降，但Ischemia & SC组术后21 d下降的程度不如Ischemia & EE组大，Sham & SC组在以上实验的各时点有上下波动，但变化不大，各组跑梯实验、前肢放置实验、前肢不对称实验和前爪伸曲实验错误评分在组间、时点间以及组间·时点间交互作用差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。

2.3 各组大鼠星形胶质细胞形态学变化透射电镜结果显示，术后21 d Sham & SC组大鼠星形胶质细胞形态和排列正常；Ischemia & SC组大鼠胶质细胞出现明显肿胀，细胞器减少；Ischemia & EE组大鼠胶质细胞肿胀较Ischemia & SC组明显减轻。见图1。

Figure 1 Effect of EE on the astrocytes morphology in the perivascular in the ipsilateral cortex

2.4 各组大鼠缺血组织t-ERK1/2、p-ERK1/2蛋白变化 Western blotting结果显示，术后21 d，3组t-ERK1/2蛋白相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)；Ischemia & SC组p-ERK1/2表达量明显高于Ischemia & EE组，Sham & SC组明显低于Ischemia & SC组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

*P值<0.05与Ischemia & EE组比较 #P值<0.05与Ischemia & SC组比较(SNK-q检验)

3 讨论

EE是指在社会交往和生存环境2个方面比标准环境更加复杂的环境。在EE中，物理运动、感官刺激、社会交往的机会增多，使动物行为呈多样化，为动物的天然偏爱和本能行为提供了适当的环境[9-10]。研究证实，EE作为一种有效和便捷的干预方式，可以明显延缓神经退行性病变和外伤后脑部神经元的康复[11]。动物研究表明，EE可以刺激海马神经元新生和突触可塑性，对由外伤或缺血所致的认知损伤具有明显的改善作用[12]。EE可以给予大鼠更多的感知觉刺激，促进动物记忆和学习的能力。姜敏等[13]在研究中指出，EE喂养下的大鼠大脑体积和皮质重量均有所增加，神经递质活动增强，并导致动物的行为学改变。本研究结果显示，Ischemia & EE组大鼠在术后14 d、21 d跑梯实验、前肢放置实验、前肢不对称实验、前爪伸曲实验等行为学实验评分均明显低于Ischemia & SC组。说明EE饲养可以明显促进脑缺血后大鼠上肢精细功能的康复。

以跑梯实验、前爪伸曲实验为代表的上肢精细功能的康复，提示EE可以作为脑缺血后肢体功能障碍的干预措施。Nozari等[14]报道称脑血管病皮层周围神经元损伤会导致患者出现肢体功能障碍；改善神经再生环境，促进残存神经元突触与下级神经元建立联系，可以明显恢复由神经元损伤引起的上肢功能缺陷。Wadowska等[15]指出，EE通过激活神经突触修复的代偿机制，促进大脑胶质细胞增生，使胶质细胞形态学发生良性改变。本研究利用透射电镜观察大鼠胶质细胞形态学变化，结果显示与Ischemia & SC组大鼠相比，Ischemia & EE组胶质细胞肿胀明显减轻。提示EE可以明显改善脑缺血后胶质细胞肿胀情况。宋名杨等[16]也证实EE可以促进神经母细胞增生、增加树突分支和树突棘密度，使局部神经元突触数量增加，提高大脑神经可塑性，并对实验动物的行为和智力产生积极影响。

ERK1/2是丝裂原活化蛋白激酶途径的关键调控因子，在整合细胞增殖、氧化应激等多种信号通路中发挥重要作用[17]。研究发现，发生损伤肿胀的脑胶质细胞p-ERK1/2水平显著升高，p-ERK1/2活化水平与脑缺血后神经功能康复程度呈负相关[18]。Jiang等[19]认为ERK1/2活化导致的脑细胞损伤可能与神经炎症反应有关，神经炎症反应会加重缺氧缺血性脑损伤并诱发继发性脑损伤。本研究结果显示，Ischemia & EE组大鼠缺血脑组织p-ERK1/2蛋白明显降低。表明抑制ERK1/2信号通路可能与EE改善脑缺血后大鼠神经功能有关。Liu等[20]报道称脑创伤后大鼠脑组织ERK1/2活性明显增高，预处理ERK1/2抑制剂(PD98059)的大鼠脑创伤后神经细胞凋亡数量明显减少，创伤后7 d皮质损伤体积明显缩小。

综上所述，EE可能通过抑制ERK1/2信号通路促进脑缺血后大鼠神经功能的恢复，其可以作为脑卒中后神经功能损伤的有效干预措施。

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丰富环境通过ERK1/2信号通路促进脑缺血后神经功能恢复

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

Enriched environment promotes poststroke neurological function recovery through regulation ERK1/2 pathway

2 结果

3 讨论