手足口病是一种传染性疾病，是由多种病原学引起的。通常认为肠道病毒属柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CV-A16)、肠病毒71型(enterovirus 71，EV71)和柯萨奇病毒A组6型(coxsackievirus A6,CV-A6)是主要的致病原因[1]。这3种病毒均会引起无菌性脑膜炎、脑炎甚至瘫痪。CV-A16被认为是最主要的血清型，可导致无症状或轻度的手足口病，在大多数情况下会自动痊愈。但CV-A16和CV-A6引起脑炎的概率远远小于EV71。EV71是一种可引起手足口病相关神经系统疾病的神经病毒[2]，多发生于学龄前儿童，5岁以下发病率最高[3]。由于EV71的特性，故受到了越来越多的关注。本研究旨在通过分析外周血Toll样受体4(Toll like reseptor 4，TLR4)和核因子κB(nuclear factor kappa B ，NF-κB)的含量探讨TLR4/NF-κB炎症通路与手足口病严重程度的关系，报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选择2015年2月—2017年2月河北医科大学附属河北省儿童医院门诊治疗并确诊的手足口病患儿78例，按病原体分为EV71感染手足口病组(EV71组)34例和非EV71感染手足口病组(非EV71组)44例；按是否存在神经系统并发症分为手足口病普通型组(普通型组)47例和手足口病重症型组(重症型组)31例。EV71感染手足口病组男性18例，女性16例，年龄1岁1个月～5岁，平均(3.15±1.01)岁，其中重症手足病患儿27例。非EV71感染手足口病组男性24例，女性20例，年龄 1岁2个月～5岁，平均(3.60±0.94)岁，其中重症手足病患儿4例。手足口病诊断标准依据手足口病诊疗指南(2018年版)[4]。另选择同期健康查体儿童(对照组)35例，男性18例，女性17例，年龄1～5岁，平均(3.45±0.97)岁。3组性别、年龄差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。EV71感染手足口病组感染组发生重症手足口病的比例高于非EV71感染手足口病组，差异有统计学意义(P<0.05)。
本研究经医院伦理委员会批准；所有治疗获得患儿家属知情同意并签署知情同意书。
1.2 方法 采集所有受试者外周血，血液样本立即置入-80 ℃冰箱内保存。所有受试者取样时均没有出现伴随疾病症状，没有显示任何血清标记物提示的自身免疫疾病，在此研究之前没有接受任何抗病毒或免疫调节治疗。采用酶联免疫吸附测定法检测受试者血清中TLLR4、NF-κB蛋白含量，实验步骤依照实验操作说明书进行。
1.3 统计学方法 应用SPSS 22.0统计软件分析数据。计量资料比较分别采用两独立样本的t检验、F检验和SNK-q检验；相关性采用Pearson相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 不同病原分型外周血TLR4、NF-κB含量比较 EV71组和非EV71组外周血中TLR4和NF-κB含量高于对照组，EV71组外周血中TLR4和NF-κB含量高于非EV71组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。
表1 不同病原分型外周血中TLR4、NF-κB含量比较
Table 1 Comparison of TLR4 and NF-κB in peripheral blood of different pathogenic types
组别 例数TLR4 NF-κB 对照组356.09±14.665.01±2.23非EV71组4411.83±8.43*11.04±5.18*EV71组3421.53±8.85*#25.48±14.98*# F值36.32348.349 P值0.0000.000
*P值<0.05与对照组比较 #P值<0.05与非EV71组比较(SNK-q检验)
2.2 不同严重程度手足口病患儿外周血TLR4、NF-κB含量比较 重症型组外周血TLR4和NF-κB含量高于普通型组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。
2.3 相关性分析 手足口病病原与外周血TLR4和NF-κB含量呈正相关(r=0.755、0.849，P<0.05)。手足口病严重程度与外周血TLR4和NF-κB含量呈正相关(r=0.660、0.741，P<0.05)。控制变数病情轻重后，非EV71感染和EV71感染手足口病组与手足口患儿外周血TLR4和NF-κB含量呈正相关(r=0.357、0.584，P<0.05)。
表2 不同严重程度手足口病患儿外周血中TLR4、NF-κB含量比较
Table 2 Comparison of TLR4 and NF-κB levels in peripheral blood of children with hand, foot and mouth disease of different severity
组别例数TLR4 NF-κB 普通型组4712.51±6.4311.94±6.48重症型组3122.81±4.6825.12±4.92t值7.6679.626P值0.0000.000
3 讨 论
手足口病是肠道病毒感染引起的常见传染性疾病，多为无症状和轻症患儿，可很快痊愈；少数患儿可演变成重症，出现脑炎、脑膜炎、脑干脑炎等神经系统并发症，极少数还可能出现心肌炎、下肢急性迟缓性瘫痪等并发症，甚至发展成危重症，引起多器官功能衰竭、死亡。近年来，随着对病因学研究的深入，发现重症患儿多由EV71感染所致。本研究旨在分析TLR4/NF-κB炎症信号通路与手足口病病原和严重程度的关系，将手足口病患儿分为EV71组和非EV71组，EV71组神经系统受累重症率高于非EV71组，差异有统计学意义(P<0.05)。表明患儿神经系统表现可能与肠道病毒分型相关。如何有效地改善手足口病患儿的病情以及提高患儿生活质量是治疗手足口病的一大难题。因此，手足口病患儿迫切需要找到一个可能为未来分子靶向治疗提供理想可靠的分子靶标。
Toll样受体家族是一种在炎症中起重要作用的一种传递炎症信号门户蛋白，能够结合其相对应的配体产生信号转导，启动其参与炎症反应相关的基因转录，进而释放炎症因子，在炎症反应中发挥作用。TLR4是其中最重要的一员。TLR4受体可分为内源性配体和外源性配体。NF-κB是TLR4下游一种重要的信号分子，不但在免疫炎症基因调节中起重要作用，而且对炎症因子的分泌也起着至关重要的作用，共同组成TLR4/NF-κB信号通路，虽然不是唯一的炎症过程，但在炎症反应中却有着不可替代的地位，被认为是最重要的炎症反应通路。
病毒一旦感染机体，其RNA就会被识别为病原体相关分子受体，进而激发炎症反应。TLRs被激活引起一系列炎症反应，促进宿主细胞因子及促炎因子的产生[5]。近年来研究发现，TLR4信号传导通路在多种病毒感染包括乙型肝炎病毒、疱疹病毒后被激活，对疾病的发生发展起着重要作用[6]。最新研究发现，TLR4/NF-κB信号通路通过调节巨噬细胞活化和炎症反应对脓毒症相关急性呼吸窘迫综合征产生影响[7]。但TLR4/NF-κB信号通路是否参与EV71病毒感染的手足口病脑炎并不十分清楚。TLR4是最早发现的哺乳动物Toll样受体，存在于人体内多种细胞中，主要分布于单核细胞/巨噬细胞、冠状动脉内皮细胞、肾小管上皮细胞等，在人脑内主要分布于脑室周围血管丛、小胶质细胞、星形胶质细胞等[8]。NF-κB是细胞中重要的转录调节因子，广泛存在于真核细胞内，主要与细胞内的信息传递并导致相关因子表达有关，在信号转导、神经塑形、神经变性和神经发育等方面具有独特作用[9]。NF-κB位于TLR4下游信号通路，被认为是炎症级联反应的重要始动因素。朱磊等[10]报道，TLR4/NF-κB信号通路可能参与危重型手足口病的病理生理过程。本研究结果显示，病情严重程度与手足口病患儿外周血TLR4和NF-κB含量呈正相关(P<0.05)。动态观察外周血NF-κB含量对于手足口病变的早期诊断具有重要意义，且对于手足口病严重程度亦有一定的指导意义，可为临床鉴别轻重症患儿提供参考，从而进一步指导临床早期有效干预，提高临床治愈率，减低病死率。但其具体的机制尚有待进一步的基础和临床研究。
NF-κB是一种广泛存在的转录因子，可在多种细胞中被激活，通过调节多种细胞因子的表达，在应激反应、炎症反应、细胞炎症等生命活动中起重要作用[11]。而EV71感染可以刺激NF-κB因子的产生。作为EV71感染的入口，肠道对于病毒复制和EV71感染期间传播非常重要。炎症反应可能对EV71发病机制有重要影响，但这仍有待进一步阐明。严重的EV71感染可能是由于机体内的TLR信号减弱，故会阻碍关键防御，导致病毒逃避，然后系统地传播[12]。NF-κB作为始发炎症反应的上游，活化后与相应靶基因结合，调控一系列炎性因子表达。本研究结果显示，非EV71组和EV71组外周血中TLR4和NF-κB含量高于对照组，EV71组外周血中TLR4和NF-κB含量高于非EV71组，差异有统计学意义(P<0.05)。表明肠道病毒感染可促进炎性细胞因子TLR4的诱导，EV71感染的手足口病患儿尤其明显，且病情严重程度与外周血TLR4含量呈正相关。肠道病毒感染大量促炎因子、趋化因子和黏附因子通过TLR4/NF-κB信号通路与TLR4及其配体相互作用、相互影响共同促进了炎症进展[13]。当外源病原体侵入机体，如各种病毒极易激活TLR4信号通路引起一系列炎症因子分泌。Toll样受体分布广泛，其最突出的生物学功能是促进促炎因子、趋化因子、黏附因子的合成和释放，引发炎症反应[14]。TLR4可以激活NF-κB，使其转位进入细胞核，激活靶基因转录，引起细胞因子合成和释放，如肿瘤坏死因子α、白细胞介素6及白细胞介素8等，诱发机体产生级联“瀑布式”炎症反应，最终引起一系列的免疫和炎症反应[15-16]。可见炎症因子的上游调节信号通路主要为TLRs/NF-κB途径。所以，EV71病毒感染能够激活TLR4信号通路，但具体机制仍不清楚。
综上所述，EV71型感染的手足口病能够引起TLR4/NF-κB信号通路激活，提示手足口病的发生发展过程与肠道病毒感染密切相关。EV71型病毒感染易引起手足口病患儿出现神经系统改变，表明EV71肠道病毒引起的手足口病对神经系统体征改变有着重要的影响。本研究结果表明EV71型感染的手足口病更易激活TLR4/NF-κB炎症通路，促使炎症因子的分泌，进而加重病情的进展。其中具体的机制尚待进一步研究和探讨。
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