超声造影剂是微米量级的由脂类体或者蛋白膜包裹的可溶性气体形成的微气泡，已经广泛应用于各类疾病的诊断，如评估心肌缺血、梗死面积、心肌存活性。经静脉造影可判断占位性病变的良恶性，向腔内注射造影剂还可以评估胃肠道膀胱肿瘤、输尿管和输卵管的通畅性等[1-3]。近年来，一些研究者开始研究造影剂的治疗作用。大量实验研究表明，超声造影剂可以增强高强度聚焦超声(high intensity focused uitrasound,HIFU)的效率及提高治疗效果。但是HIFU联合超声造影剂时，经静脉注射造影剂后造影剂随血流分布全身，造成靶组织内造影剂浓度偏低，由于微泡在超声波作用下瞬间空化还可能造成靶组织以外的组织器官损伤。目前超声造影剂的使用多是经周围静脉注射，而对其经皮组织间注射所引起的超声变化研究较少。国内使用的多是第三代造影剂SonoVue，由氟碳类气体微泡与磷脂包膜组成，微泡直径多为2.00～6.00 μm，与红细胞的直径相近，不能透过血管内皮渗透入间质组织。反之，经皮穿刺注入组织间的造影剂也不能进入血管经呼吸作用排出体外，而只能通过淋巴回流缓慢弥散。本研究采用皮下注射造影剂进入肝组织内，旨在观察肝组织间质内的造影剂超声表现、代谢规律及造影剂对肝细胞的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组 健康成年新西兰兔30只，由河北省实验动物中心提供并检疫，雌雄不限，体重2.4～3.1 kg，饲养环境清洁级，将其分为注射造影剂0.1 mL组、0.2 mL组、0.3 mL组、0.4 mL组、0.5 mL组，以及注射同等量生理盐水的对照组各5只。
1.2 实验设备与试剂制备 应用飞利普IU22超声彩色多普勒诊断仪，采用L9-3高频线阵探头，频率4～9 MHz。仪器所有条件设置为同一标准：二次谐波时机械指数设定为0.06，显像深度、时间增益补偿、总增益、聚焦范围等各参数均调整至最佳状态，造影前常规基波超声，充分显示后开启谐波造影。
超声造影剂采用意大利BRACCO公司生产的SonoVue，每瓶含六氟化硫气体59 mg及白色冻干粉25 mg，使用时向瓶内注入5 mL生理盐水(0.9% NaCl)并振荡约20 s使冻干粉溶解，配制完成造影剂内微泡浓度在(1～5)×108个/mL，微泡粒直径小于8 μm。
1.3 实验方法 使用2%苯巴比妥钠对兔腹腔注射麻醉满意后，建立兔耳缘静脉用于补液，将兔固定于实验床上，用脱毛剂脱兔腹部毛。常规基波超声扫查，在超声引导下用注射器向兔肝脏内注射配置好的造影剂，各实验组注射相应剂量。对照组5只分别注射0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL生理盐水。观察造影剂逐渐消退情况，每2 min采集保存1幅B型超声图像，1 h后每5 min观察保存超声图像。在造影剂完全消退后立即处死兔，在无菌条件下取造影处的肝组织，10%甲醛溶液固定，石蜡包埋切片后进行HE染色，在光学显微镜下观察肝细胞有无损伤及损伤程度并拍照。将各组B超声像图分别导入GrayAnalyse软件，计算造影增强区域随时间推移灰度值的变化情况。
1.4 统计学方法 应用SPSS 19.0统计软件分析数据。计量资料比较采用重复测量的方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 各组平均灰度值比较 对照组肝脏平均灰度值无明显变化，各实验组注射造影剂后平均灰度值明显增高，且随剂量增加平均灰度值增高，30 min内各实验组平均灰度值保持在较高水平，后逐渐减低，注射剂量越多平均灰度值降低速度越慢，200 min后注射区平均灰度值仍高于周围正常肝组织，其组间、时点间、组间·时点间交互作用差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。
表1 各组平均灰度值比较
Table 1 Comparison of average grayscale values in each group
组别 平均灰度值0 min50 min100 min150 min200 min0.1 mL组98.470±1.43252.506±1.01249.348±1.60745.734±1.78244.466±1.0270.2 mL组108.150±1.01457.246±0.82452.652±1.65750.454±1.97345.800±1.0770.3 mL组109.278±1.06960.450±1.08158.182±1.84350.842±1.44846.696±1.8660.4 mL组113.310±1.92573.614±1.74461.138±1.55254.940±1.49447.124±1.5710.5 mL组119.954±1.37986.220±1.46068.330±1.71357.156±1.52147.486±1.612组间F值=18 410.375 P值=0.000时点间F值=1 361.508 P值=0.000组间·时点间F值=136.411 P值=0.000
2.2 造影增强区的超声图像随时间变化的特征表现 将超声造影剂注射入肝组织后实时超声动态观察兔肝脏内造影剂的弥散和消退(图1)。初始造影区内呈较均匀高回声，边界光滑锐利，与正常肝组织分界明显，随时间推移造影区边缘渐渐模糊。造影区内灰度值不均匀减低，渐渐呈点片状强回声，最终点片状回声变淡消失，造影区内回声均匀，边界清晰。实验过程中可观察到以下3种特殊现象：血管灌注增强现象(图2)，5组实验中造影剂经皮注射入肝组织后均可立即观察到动静脉内造影剂显影，显影程度与注射量呈正相关，约12 min后显影完全消失；造影增强区边缘钝化现象(图3)，造影增强区初始边缘锐利，与肝组织分界清晰，随后边界逐渐模糊，似云雾状；造影区繁星征(图4)，造影区回声强度并不是随时间均匀减低，而是由团状强回声渐变为星点状强回声，最终呈均匀稍强回声。
2.3 造影增强区肝组织的病理改变 实验期间所有兔存活，造影后各组肝组织病理结果均显示肝细胞形态正常，未见肿胀坏死，组织结构排列整齐，肝组织间质内观察到淋巴细胞聚集(图5)，对照组肝组织内未见淋巴细胞(图6)。
3 讨 论
本研究应用经皮兔肝组织内注射超声造影剂连续观察了造影剂在肝组织内的变化特点，初步验证了造影剂注入肝组织的可行性，结果显示造影剂在肝组织内可以存在很长时间，30 min内保持较高浓度。观察到了造影剂在肝组织内特征性的超声表现。血管灌注增强现象考虑为造影剂注射时压力较高，造影剂由穿刺造成的组织破损进入血液，从而造成血管灌注增强。造影增强区边缘钝化现象考虑为造影剂微气泡向周围肝组织扩散所致。造影区繁星征，考虑由于造影剂虽然理化性质稳定，但极易聚集，可在重力作用下沉积，并聚集吸附成团，造成局部造影剂聚集，而随着增强区域内造影剂随淋巴回流减少，聚集的造影剂逐渐显现，故表现为星点状强回声。
本研究在注射SonoVue后均可立即获得注射区内增强图像，且注射剂量越多，增强区域体积越大。但高剂量组平均灰度值高于低剂量组，其原因可能是当在肝内注射造影剂后，局部压力增加，高剂量组压力高造影剂趋向于聚集，低剂量组压力相对较低造影剂易在组织内分散，从而使高剂量组造影剂在组织内的浓度较低剂量组高，造成平均灰度值较低剂量组高。肝组织内的造影剂主要通过淋巴系统回流，速度缓慢，故造影增强时间显著延长。此外，注射区在200 min后平均灰度值仍高于周围肝组织，分析可能是造影剂聚集造成的局部肝组织炎性反应，病理结果显示注射区内淋巴细胞增多聚集。
超声造影剂SonoVue目前已经广泛应用于临床，其具有无放射学辐射、操作简便、实时显像等优势。SonoVue具有良好的稳定性及声学特性，经静脉注射后在血管内可视为一种流变学特性类似于红细胞的示踪剂，其在血管内的分布、流速、微循环通过时间等与红细胞相同，故经周围静脉注射超声造影剂实现了实时动态观察人体肝脏、心脏、肾脏等脏器血流灌注情况。随着医疗技术的发展，众多研究者试图通过经皮注射造影剂开发造影剂更多的用途，以便为临床提供更多的诊断信息。已有研究发现，经皮注射超声造影成像可在区分舌癌头颈淋巴结转移中发挥重要作用[4-5]。钟丽瑶等[6] 应用经皮下注射超声造影剂评估乳腺癌前哨淋巴结转移，发现经皮下注射超声造影剂除可较好地定位前哨淋巴结外，还能对前哨淋巴结内是否存在转移灶进行准确定位。还有研究者尝试将关节腔内超声造影应用于临床，El-Dalati等[7]研究发现关节腔内造影可以显著提高肩袖撕裂诊断的准确性。Cheng等[8]发现通过腔内注射超声造影剂可有效评估粘连性关节囊炎。经皮注射造影剂组织显影的方法还有很多值得研究的问题，可以克服经静脉注射造影剂的缺点：①造影剂随血流排空过快；②增强时间短；③持续静脉注射造影剂可能因剂量过多引起不良反应。
3.1 经静脉途径肝脏超声造影在临床治疗中的局限性 静脉注射超声造影剂作为增效剂增加高强度聚焦超声的治疗效果，发现治疗中存在造影剂随血流排空过快、增强时间短的问题，而持续静脉注射造影剂又可能因剂量过多引起不良反应[9-12]。静脉注射后SonoVue气泡可通过肺循环进入动脉系统参与全身血液循环。六氟化硫是SonoVue的活性成分，能很快地经肺循环排出体外，平均消除半衰期为12 min，注射剂量的40%～50%在注射后1 min内排除，15 min后几乎所有的六氟化硫气体已排除。SonoVue的清除与剂量和性别无关。Cheng等[13]分析了2 604例接受HIFU 治疗的子宫肌瘤患者， 其中1 300 例患者在治疗过程中使用了超声造影剂，结果发现HIFU 治疗过程中，使用造影剂组下腹痛、下肢疼痛、骶部/臀部疼痛、腹股沟区疼痛、治疗区域疼痛和皮肤不适热感的发生率高于未使用造影剂组(P<0.05)。Hwang等[14]将SonoVue经耳缘静脉注入活体兔血管内，选取直径为1 mm的血管给予不同声压HIFU辐照，发现血管通透性增加，电镜扫描发现血管内皮不同程度损伤，而对照组未见血管通透性改变及内皮损伤。说明经静脉途径超声造影在HIFU治疗中更容易导致各种不良反应。
3.2 经皮肝组织内注射超声造影剂的可行性 与经周围静脉注射造影剂采用血管成像的方式不同，经皮注射造影剂进入肝脏后是组织间质成像。经皮肝组织内注射造影剂可以显示淋巴管和淋巴结。毛细淋巴管由一层无平滑肌的内皮细胞组成，细胞间隙较宽，且具有很强的吞饮作用，造影剂可轻易进入毛细淋巴管，血管内皮细胞间隙较窄导致造影剂微泡无法通过血管壁进入血液[15-17]。因此，肝组织内的造影剂主要通过淋巴系统回流，40%～50%进入胸导管，其余的一部分进入腹腔淋巴结，一部分进入胸腔淋巴结。胸导管的淋巴流量为120 mL/h，肝淋巴占40%～50%，一般为50～60 mL/h[18]。淋巴回流速度缓慢，造影剂经皮穿刺注入肝组织造影剂可停留很长时间，使得造影增强时间明显延长。在经过短暂血管造影剂增强显影后，注射区周围肝组织无造影剂，而注射区域仍保持较高的浓度。
3.3 经皮肝组织内注射超声造影剂的治疗意义 经皮肝组织内注射超声造影剂增强时间较经周围静脉注射造影剂明显延长，且注射区内造影剂可在30 min内保持较高浓度，而注射区周围组织内无造影剂。此特性如应用于HIFU治疗中，能够有效增加高强度聚焦超声的治疗效果，减少不良反应发生率。实验证实，超声造影剂、碘化油、无水乙醇等物质可以增加HIFU消融的靶区凝固性坏死范围和程度，提高HIFU的治疗效果[19-20]。
3.4 经皮肝组织内注射超声造影剂淋巴结增强的治疗意义 SonoVue通过淋巴系统回流为诊断淋巴结腹腔及胸腔转移提供了可能。李雪峰等[21]研究发现，经皮肝超声造影显像可提供肝癌腹腔淋巴转移情况的信息，为选择治疗方式及分析预后提供了重要依据。传统肿瘤化疗过程中，药物需通过血管内皮、肿瘤细胞间隙、淋巴内皮、淋巴管一系列屏障才能最终到达转移淋巴结发挥抗癌作用，而转移淋巴结处药物浓度低，不能有效杀灭转移肿瘤细胞，临床医生为达到更好的治疗效果常增大用药量，这会对患者其他正常组织造成更大的损害。因此，化疗对肿瘤淋巴结转移的治疗成为一大难点。使用超声靶向微泡破坏技术将超声造影剂微泡作为药物或基因的载体注射入目标附近组织区域内，造影剂经淋巴回流进入淋巴管及淋巴结，通过不同声强超声辐照最终在特定淋巴结释放，不仅可以提高目标区域的药物浓度，还可以沿淋巴系统杀灭肿瘤细胞，使其发挥靶向治疗作用，有效遏制转移。
3.5 实验的不足 本研究由于操作不熟练且对造影剂的注射部位缺乏经验，穿刺针易误入血管及胆管，使得注射过程中造影剂大部分进入管腔。本研究未进行造影剂肝内注射量与造影增强区域体积的对比观察，有待以后进一步深入探讨。
经皮肝组织间质注射造影剂有广阔的应用前景，对于肝组织的造影评估将更加全面客观。本研究总结了造影剂在肝组织的弥散规律，造影剂在组织间质内无明显不良反应，安全可靠，为经皮肝组织间质内超声造影的临床应用提供了有力的实验依据。(本文图见封三)
[1] 马慧，王瑞霞，郑敏娟，等.胃窗超声造影对胃肿瘤的诊断价值及分型[J].河北医科大学学报，2015,36(10):1209-1211.
[2] Macri F,Di Pietro S,Mangano C,et al. Quantitative evaluation of canine urinary bladder transitional cell carcinoma using contrast-enhanced ultrasonography[J]. BMC Vet Res，2018，14(1):84.
[3] Mandia L,Personeni C,Antonazzo P,et al. Ultrasound in infertility setting:optimal strategy to evaluate the assessment of tubal patency[J]. Biomed Res Int，2017，2017:3205895.
[4] Gvetadze SR,Xiong P,Lv M,et al. Contrast-enhanced ultrasound mapping of sentinel lymph nodes in oral tongue cancer-a pilotstudy[J]. Dentomaxillofac Radiol，2017，46(3):20160345.
[5] Cui Z，Gao Y，Wang W，et al. Evaluation of neck lymph node metastasis on contrast-enhanced ultrasound:an animal study[J]. Clin Exp Otorhinolaryngol，2017，10(1):109-114.
[6] 钟丽瑶，曹泽民.经皮注射淋巴结超声造影与常规超声对乳腺癌前哨淋巴结的诊断价值比较[J]. 中华超声影像学杂志，2011，19(2)：92-95.
[7] El-Dalati G,Castellarin G,Martone E,et al. Standard sonography and arthrosonography in the study of rotatorcuff tears[J]. Radiol Med,2005,110(5/6):616-622.
[8] Cheng X,Zhang Z,Xuanyan G,et al. Adhesive capsulitis of the shoulder:evaluation with US-arthrography using a sonographic contrast agent[J]. Sci Rep，2017，7(1):5551.
[9] Liu Z，Gao S，Zhao Y，et al. Disruption of tumor neovasculature by microbubble enhanced ultrasound： a potential new physical therapy of anti- angiogenesis [J]. Ultrasound Med Biol,2012,38(2)：253-261.
[10] Cheng C,Xiao Z,Huang G,et al. Enhancing ablation effects of a microbubble contrast agent on high-intensity focused ultrasound:an experimental and clinical study[J]. BJOG，2017，124(Suppl 3):78-86.
[11] 张婷，李发琪，陈首名，等.高强度聚焦超声联合微泡损伤山羊肝的增效性研究[J].中华超声影像学杂志，2008，17(4)：354-357.
[12] 付丽媛，李发琪，陈首名，等.不同剂量微泡对比剂在高强度聚焦超声消融活体羊肝组织中的增效效应[J].中华超声影像学杂志，2009，18(4)：343-345.
[13] Cheng CQ，Zhang RT，Xiong Y，et al. Contrast-enhanced ultrasound for evaluation of high-intensity focused ultrasound treatment of benign uterine diseases retrospective analysis of contrast safety[J]. Medicine (Baltimore)，2015，94(16):e729.
[14] Hwang JH,Brayman AA,Reidy MA,et al. Vascular effects induced by combined 1-MHz ultrasound and microbubble contrast agent treatments in vivo[J]. Ultrasound Med Biol,2005,31(4):553-564.
[15] Kawai Y,Ajima K,Nagai T,et al. Real-time imaging of the lymphatic channels and sentinel lymph nodes of the stomach using contrast-enhanced ultrasonography with Sonazoid in a porcine model[J]. Cancer Sci,2011,102(11):2073-2081.
[16] Goldberg BB,Merton DA,Liu JB,et al. Contrast-enhanced ultrasound imaging of sentinel lymph nodes after peritumoral administration of Sonazoid in a melanoma tumor animal model[J]. J Ultrasound Med,2011,30(4):441-453.
[17] 董磊，王双龙，张彦，等.经皮经肝淋巴超声造影检测兔VX2肝癌前哨淋巴结的实验研究[J].中华超声影像学杂志，2013,22(2)：158-161.
[18] 刘执玉.淋巴学[M].北京：中国医药科技出版社，1996：100-101.
[19] Tung YS，Liu HL，Wu CC,et al. Contrast-agent-enhanced ultrasound thermal ablation[J]. Ultrasound Med Biol，2006,32(7):1103-1110.
[20] Yu T,Xiong S,Mason TJ,et al. The use of a micro-bubble agent to enhance rabbit liver destruction using high intensity focused ultrasound[J]. Ultrason Sonochem，2006,13(2):143-149.
[21] 李雪峰，王双龙，于美，等.经皮经肝超声造影显像评估兔 VX2 肝癌腹腔淋巴结转移的实验研究[J].山东大学学报：医学版，2014，53(6)：13-17.