秦皮是木犀科植物苦枥白蜡树Fraxinus rhynchophylla Hance.、白蜡树Fraxinus Chinensis Roxb.、尖叶白蜡树Fraxinus szaboana Lingelsh.和宿柱白蜡树Fraxinus stylosa Lingelsh.的干燥枝皮或干皮，为临床常用中药，具有清热燥湿、收涩止痢、止带、明目之功效，临床上多用于湿热泻痢、赤白带下、目赤肿痛、目生翳膜等症[1]。现代药理学研究表明其具有抗菌、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等作用[2-4]。除《中国药典》2015年版规定的这4种秦皮外，同属植物秦岭白蜡树、黑蜡子树、毛白蜡树也混淆于市场中做秦皮用[5-6]，且由于受地理因素和生长环境的影响，不同产区包括栽培和野生秦皮的化学组成不尽相同[7-8]。对药材的外观检查、鉴别及对几个成分的含量测定[9-11]已不能完全反映其内在质量。中药指纹图谱因能反映组成中药多种化学成分的整体全貌，已成为国际公认的控制中药或天然药物质量的有效手段[12-14]。为更全面表征秦皮的整体特征，本研究拟建立秦皮药材及其混淆品的高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)指纹图谱分析方法，并对不同品种秦皮间的差异进行比较，以期为秦皮的质量控制提供新依据，报告如下。
1 材料与方法
1.1 仪器 Agilent 1200高效液相色谱仪，包括二极管阵列检测器、四元泵、自动进样器、在线脱气系统和柱温箱；Agilent Chemstation System色谱工作站(Agilent科技有限公司)。分析天平，BP211D型(北京赛多利斯仪器有限公司)；超声波清洗器，KQ5200E型(江苏昆山市超声仪器有限公司)；LG16-B型雷勃尔高速离心机(北京雷勃尔离心机有限公司)。中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)。
1.2 试药 色谱纯甲醇(美国J.T.Baker公司)用于秦皮样品提取物的制备和分析；色谱纯乙酸购于迪马科技公司；水为娃哈哈纯净水(中国杭州娃哈哈集团有限公司)。
对照品秦皮甲素(批号为110741-200506)、秦皮乙素(批号为110741-200506)、秦皮素(批号为111731-200501)、莨菪亭(批号为110768-200504)、异莨菪亭(批号为111741-200501)、丁香苷(批号为111574-200603)，均由中国食品药品检定研究院提供(中国北京)。对照品秦皮苷(批号为20111214)、橄榄苦苷(批号为20111214)、毛柳苷(批号为20110921)购于鼎瑞化工(上海)有限公司；对照品6-羟基-7,8-二甲氧基香豆素、8-羟基-6,7-二甲氧基香豆素由中国中医科学院中医基础理论研究所提供，经HPLC分析，纯度均大于98%。
55批样品采集于国内各产地，为不同批次样品(表1)。样品A1～A5、B1～B5、C1～C5、D1～D5分别来源于白蜡树、尖叶白蜡树、苦枥白蜡树和宿柱白蜡树；W1～W3秦皮混淆品分别来源于毛白蜡树、黑蜡子树和秦岭白蜡树。以上样品均由中国中医研究院刘丽梅教授提供。样品Sd为秦皮对照药材——白蜡树，购于中国食品药品检定研究院。市售样品S1～S31采购于全国各药店。
表1 秦皮样品来源
Table 1 Origins of Cortex Fraxini samples
类别编号产地购买地A白蜡树A1未知广西A2四川峨眉川主乡东岳村四川A3四川峨眉川主乡顺河村四川A4四川峨眉川主乡梧桐村四川A5四川峨眉川主乡高河村四川B 尖叶白蜡树B1未知山东B2辽宁辽宁B3新疆新疆B4未知吉林B5未知辽宁C 苦枥白蜡树C1未知陕西C2未知陕西C3未知安徽C4未知山西C5未知安徽D 宿柱白蜡树D1陕西山阳县李家坪陕西D2陕西商南县杨家沟陕西D3陕西商南县马房沟陕西D4陕西商南县二道河陕西D5陕西商南县石门镇王河村陕西S自购药材S1陕西河北S2陕西江苏S3陕西商洛陕西S4陕西安徽S5陕西安徽S6吉林广东S7吉林河北
表1 (续)
S8吉林河南S9吉林吉林S10辽宁广东S11辽宁湖南S12辽宁安徽S13内蒙古河北S14安徽江苏S15安徽江苏S16安徽安徽S17云南浙江S18云南安徽S19河南广西S20河南广西S21河南北京S22河南河北S23四川安徽S24四川安徽S25四川四川S26贵州四川S27贵州浙江S28贵州安徽S29宁夏安徽S30河北安徽S31湖南河北对照药材Sd中国食品药品检定研究院W混淆品 白毛蜡树W1西安植物园陕西 黑蜡子树W2陕西商南县陕西 秦岭白蜡树W3秦岭宁陕菜子坪林场陕西
1.3 色谱条件 色谱条件：Zorbax SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；柱温30 ℃。流动相：A为甲醇，B为0.5‰乙酸水缓冲溶液。梯度洗脱，洗脱程序：5%～20% A(0～5 min)，20% A(5～20 min)，20%～60% A(20～75 min)，进样前预平衡8 min。流速：1.0 mL/min。进样量：10 μL。检测波长：230 nm。
1.4 溶液制备
1.4.1 对照品溶液制备 分别精密称取11种化学成分对照品适量，溶解于甲醇配制成一定浓度的贮备液。分别精密量取一定体积贮备液混匀于10 mL量瓶中，加73%甲醇定容，得混合对照品溶液。最终混合对照品溶液中各对照品浓度分别为秦皮甲素451.91 mg/L，秦皮乙素85.00 mg/L，秦皮苷388.02 mg/L，秦皮素94.01 mg/L，莨菪亭5.13 mg/L，异莨菪亭4.25 mg/L，橄榄苦苷5.08 mg/L，毛柳苷5.48 mg/L，丁香苷10.15 mg/L，6-羟基-7,8-二甲氧基香豆素5.40 mg/L，8-羟基-6,7-二甲氧基香豆素4.05 mg/L。所有对照品溶液储存于4 ℃环境中，以备使用。
1.4.2 供试品溶液制备 将55批次干燥药材分别粉碎，过60目筛备用。取秦皮干燥粉末约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入73%甲醇10 mL，称定重量，于冰水浴中超声提取65 min后，取出，放冷，用73%甲醇补足减失重量，摇匀，于14 000 r/min离心10 min，取上清液过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
2 结 果
2.1 方法学验证
2.1.1 系统适用性试验 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪，在确定的色谱条件下检测，记录色谱图，按秦皮甲素峰计算理论板数约为16 000，各色谱峰分离度均符合要求。
2.1.2 精密度试验 精密吸取秦皮药材(S11)同一供试品溶液10 μL，连续进样6次，记录指纹图谱。以秦皮甲素峰的保留时间和峰面积为1.0，计算各峰相对保留时间、相对峰面积及相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)。各主要色谱峰相对保留时间RSD为0.02%～0.38%，相对峰面积RSD为1.53%～3.55%，说明精密度良好。
2.1.3 重现性试验 精密称取同一批号的供试品6份，按照上述方法制备供试品溶液，分别进样，记录指纹图谱。以秦皮甲素色谱峰的保留时间和峰面积为1.0，计算各峰相对保留时间、相对峰面积及其RSD。各主要色谱峰相对保留时间RSD为0.03%～0.67%，相对峰面积RSD为1.15%～3.98%，表明方法重现性良好。
2.1.4 稳定性试验 精密吸取同一供试品溶液10 μL，分别在0，1.5，3，6，9，12，18，24，36，48，72 h各进样1次，记录指纹图谱。以秦皮甲素色谱峰的保留时间和峰面积为1.0，计算各峰相对保留时间、相对峰面积及其RSD。各主要色谱相对保留时间RSD为0.03%～0.86%，相对峰面积RSD为1.75%～4.98%，说明样品72 h内稳定。
2.2 HPLC指认秦皮样品指纹图谱中主要色谱峰 分别取11种化学成分混合对照品溶液进样分析，根据相同色谱分离条件下，同一化合物保留时间相同、紫外光谱一致的原则，比较供试品和各对照品的色谱峰，指认化合物。通过比较秦皮供试品和各对照品的色谱峰保留时间和紫外光谱图，指认出11个化合物的色谱峰，分别是毛柳苷、秦皮甲素、丁香苷、秦皮苷、秦皮乙素、秦皮素、异莨菪亭、莨菪亭、6-羟基-7,8-二甲氧基香豆素、8-羟基-6,7-二甲氧基香豆素和橄榄苦苷，其保留时间分别为13.725、14.871、21.037、22.789、24.675、31.803、36.355、38.570、44.226、45.401、58.115 min。11种对照品色谱图见图1。
图1 空白溶剂(KB)、对照品(S)、对照药材(Sd)、秦皮样品(A～D)及秦皮混淆品(W1～W3)色谱图
Figure 1 HPLC chromatogram of blank solvent(KB),standard substances(S),Cortex Fraxini(A～D) and confusable species of Cortex Fraxini(W1～W3)
2.3 秦皮样品指纹图谱分析 取52批样品，制备供试品溶液，各取10 μL分别进样，得到52批秦皮药材及其混淆品色谱图。分析结果采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A)”软件进行处理，分别建立所有秦皮样品、4种秦皮各自的指纹图谱。
2.3.1 秦皮样品分析 以购自中国食品药品检定研究院的秦皮对照药材(Sd)的指纹图谱为对照图谱(图1)，计算各样品图谱与对照图谱的相似度。52批药材得到10个共有峰。对获得的数据进行相似度分析，可将52个样品分为3类。第1类，相似度在0.8～1.0之间，共有27个样品：A2，B1，B3，B4，C2，C4，C5，S4，S5，S6，S8，S11，S12，S15，S17，S18，S19，S20，S22，S24，S25，S27，S28，S29，S30，S31，Sd，可认为其化学成分的种类和含量与对照药材相近，质量优良；第2类，相似度在0.6～0.8之间，共有20个样品：A1，A3，A5，B5，C1，C3，D1，D2，D3，D5，S1，S2，S7，S9，S13，S14，S16，S21，S23，S26，可认为其与对照药材有一定差别，质量中等；第3类，相似度在0.4～0.6之间，共有5个样品：A4，B2，D4，S3，S10，表明这些样品与对照药材化学成分的种类或含量有很大差异，质量较差。
对秦皮药材样品的指纹图谱进行直观分析，发现几乎所有秦皮样品中都含有4个主要色谱峰，即秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素。但各峰之间的峰面积比值差别较大，说明尽管化学成分种类一致，但不同类别的秦皮样品之间化学成分量的比例差异较大。其他种类化合物色谱峰或有或无，差别较大。
在收集的52批秦皮样品中，仅有27批样品被划为第一类，约占样本总数的52%，而划分在第3类的样品有5个之多，占样本总数的9.6%。表明市售秦皮药材质量参差不齐，也进一步验证了秦皮药材质量控制的必要性。
2.3.2 不同品种秦皮样品分析 各品种中，分别以A5、B3、C2、D4的指纹图谱为参照图谱，生成各自品种对照图谱(图1)，计算同品种中各样品图谱与对照图谱的相似度。结果表明，A种样品中，A2的相似度低于0.5，其余4批样品相似度均高于0.93，得到41个共有峰。B种样品中，B1的相似度低于0.5，其余4批样品相似度均高于0.83，得到24个共有峰。C种样品中，C1的相似度低于0.6，其余4批样品相似度均高于0.92，得到45个共有峰。D种样品中，D3的相似度低于0.6，其余4批样品相似度均高于0.81，得到37个共有峰。发现4种秦皮中均有一批相似度与其他4批差异较大，而其余4批样品相似度接近，均高于0.8。表明所收集的4种秦皮样品中，其各自品种内的相似度较高。
由秦皮对照药材(Sd)的指纹图谱为对照图谱计算的相似度结果可知，A、B、C、D 4个不同品种秦皮的相似度分别在0.573～0.909、0.472～0.961、0.642～0.863、0.454～0.796之间，且每种秦皮均有样品分布于上述所分第1类、第2类、第3类之中不等。表明4种秦皮与对照药材相比质量参差不齐。以Sd的指纹图谱为对照图谱，生成21批(A1～A5、B1～B5、C1～C5、D1～D5、Sd)秦皮药材指纹图谱，结果得到包括秦皮甲素、秦皮乙素、秦皮苷和秦皮素在内的11个共有峰。结合品种内共有峰的分析发现，4种秦皮所含有的共有峰数量差异较大，种类不完全相同，各品种所含主要成分量也不完全相同。综合上述分析，所收集的4种秦皮所含主要化学成分相同，但化学成分的种类和量的多少存在差异。这一结果尚需更多不同品种秦皮样品的分析进行验证。
2.4 秦皮及其混淆品分析 秦皮混淆品药材指纹图谱见图1。以购自中国食品药品检定研究院的秦皮对照药材(Sd)的指纹图谱为对照图谱，计算各样品图谱与对照图谱的相似度。结果表明，3批样品的相似度均低于0.47，且其共有峰也仅有2个。3批混淆品与对照药材的色谱峰种类、数量、含量均不相同，差异巨大，表明此法可补充作为秦皮正品和混淆品区分的办法。
3 讨 论
为确保指纹图谱信息的丰富程度和较好分离情况、较大指纹信号和良好均化程度，同时又具有较好的精密度和重现性，指纹图谱检测条件的选择至关重要。本研究采用C18色谱柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，对流动相的组成、配比、检测波长等因素进行优化，确定最佳色谱条件。在流动相系统的选择中，分别以甲醇-水，甲醇-1 mmol/L乙酸铵，甲醇-0.5‰乙酸水缓冲溶液，甲醇-1‰乙酸水缓冲溶液等不同浓度、不同比例的流动相系统进行等度和梯度洗脱试验，结果表明，用甲醇-0.5‰乙酸水缓冲溶液进行梯度洗脱为佳，加入乙酸后峰形尖锐且分离度较好，在调整好流动相的不同时间洗脱比例之后，各峰的保留时间适中，且基线较平稳，不易漂移，有利于指纹图谱的分析。
在检测波长的选择研究中，采用二极管阵列检测器对检测波长进行了考察，比较了210，220，230，245，280，310，340，380 nm 8个不同波长下的色谱图，结果显示，245，280，310 nm的色谱图基线不平，且色谱图大部分峰呈现倒峰；340，380 nm 的谱图灵敏度较低，谱图峰数目少；210，220 nm的谱图灵敏度相对较低，故这些波长不宜作为指纹图谱检测波长。而230 nm下的色谱图各个色谱峰峰形和分离度较好，色谱信息较丰富。文献报道多采用340 nm测定秦皮甲素、秦皮乙素的含量[15]。秦皮中秦皮甲素含量很高，在色谱图中占绝对优势，其他特征峰很弱，为了反映药材化学成分的全貌，可使用不同的检测波长，突出其他特征峰，相互参照辨认，并可避免图谱中仅有一种成分偏高的现象。因此，选择230 nm为秦皮药材指纹图谱的检测波长，除突出秦皮甲素色谱峰特征外，也兼顾其他峰的吸收。
综上所述，本研究建立了秦皮药材的HPLC指纹图谱分析方法，对52批秦皮药材、3批秦皮混淆品进行了相似度分析。结果表明，不同产地不同种类的药材差异很大，良莠不齐，但秦皮正品与混淆品比较可明显区分。本方法可用于秦皮药材的质量分析与评价，为秦皮的质量控制方法进行了有意义的补充。
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典,第一部[S].北京:中国医药科技出版社,2015:271.
[2] 杨炳友,闫明宇,潘娟,等.秦皮化学成分及药理作用研究进展[J].中医药信息,2016,33(6):116-119.
[3] 聂安政,林志健,张冰.秦皮化学成分和药理作用研究进展[J].中草药,2016,47(18):3332-3341.
[4] Li W,Li W,Zang L,et al. Fraxin ameliorates lipopolysaccharide-induced acute lung injury in mice by inhibiting the NF-κB and NLRP3 signalling pathways[J]. Int Immunopharmacol,2019,67:1-12.
[5] 田文帅,龙华丽,姚帅,等.秦皮及其混伪品的生药学研究现状[J].上海中医药大学学报,2017,31(1):100-106.
[6] 崔红花,王振月,左月明,等.秦皮及其3种混淆品的鉴定研究[J].中草药,2003,34(4):89-92.
[7] 周军辉,谢斌,石新卫,等.多基原秦皮药材中秦皮甲素和秦皮苷的纯化工艺研究[J].西北药学杂志,2014,29(5):449-452.
[8] 赵重博,王晶,邹俊波,等.产地加工与炮制一体化工艺对秦皮饮片抗炎作用的影响[J].世界科学技术-中医药现代化,2018,20(6):1040-1046.
[9] 田玉路,王宏侠,高萌,等.高效液相色谱法测定前胡中白花前胡甲素和白花前胡乙素的含量[J].河北医科大学学报,2017,38(3):331-335.
[10] 王芳,王亚恒,王小平,等.高效液相色谱法测定秦皮枝皮和干皮中秦皮甲素与秦皮乙素的含量[J].中南药学,2018,16(9):1299-1302.
[11] 穆希岩,付炎,张玉倩,等.UPLC同时测定秦皮配方颗粒中7种成分[J].中国实验方剂学杂志,2017,23(11):63-67.
[12] 江洁怡,胥爱丽,李养学.秦皮配方颗粒UPLC指纹图谱研究[J].辽宁中医杂志,2018,45(4):794-796.
[13] 陈菊英,黎晓丽,雷桥仕,等.白芷黄酮类成分的UPLC指纹图谱研究[J].中药材,2019,42(4):845-849.
[14] Zhang C,Zheng X,Ni H,et al. Discovery of quality control markers from traditional Chinese medicines by fingerprint-efficacy modeling:current status and future perspectives[J]. J Pharm Biomed Anal,2018,159:296-304.
[15] 杨建华,迪丽拜尔·马木提,王晓梅,等.HPLC法同时测定大鼠尿样中秦皮甲素和秦皮乙素的浓度[J].新疆医科大学学报,2018,41(8):1006-1009.