卵巢透明细胞癌是卵巢上皮恶性肿瘤的特殊病理类型，发病年龄年轻且预后较差[1]。目前上皮性卵巢癌的标准治疗方案是彻底的肿瘤细胞减灭术及铂类为基础的化疗。术后医源性绝经可导致患者生活质量下降及非癌症病死率增加。虽然绝经激素治疗(menopausal hormone therapy,MHT)可显著改善患者的绝经症状，提高患者生活质量[2]，但MHT是否会引起肿瘤残余病灶转移或复发仍有待研究。本研究通过检测MHT的关键组成部分17β-雌二醇(estradiol,E2)作用于卵巢透明细胞癌ES2细胞后，细胞增殖侵袭能力的变化，探讨E2对ES2细胞的影响，旨在为卵巢透明细胞癌患者术后MHT的安全性提供实验依据。
1 材 料 与 方 法
1.1 实验材料 卵巢透明细胞癌细胞系ES2购自美国ATCC。MTS试剂购自美国Promega公司，Transwell小室购自美国Corning公司，人工基底膜基质凝胶购自美国BD公司，蛋白裂解液购自上海贝博生物公司。AT丰富结合域1A(AT rich interaction domain 1A，ARID1A)多克隆抗体购自上海生工生物工程有限公司，β-肌动蛋白(β-actin)抗体、p53单克隆抗体、基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)单克隆抗体均购自美国Abcam公司。E2购自美国Sigma公司。
1.2 实验方法
1.2.1 细胞培养及分组 将ES2细胞接种于含有10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100 U/mL 链霉素的无酚红RPMI 1640培养基中，置于5% CO2、37 ℃培养箱中。取生长状态良好的对数期细胞进行实验。实验分为E2 10-7 mol/L组、E2 10-8 mol/L组、E2 10-9 mol/L组、E2 10-10mol/L组、E2 10-11mol/L组、溶剂对照组(含0.01% DMSO)和空白对照组。E2作用前饥饿处理细胞24 h。
1.2.2 MTS法检测不同浓度E2作用后细胞的增殖活性 E2组、溶剂对照组和空白对照组细胞均以3×103个/孔接种于96孔板中，设6复孔，培养3～4 h细胞基本贴壁后，按照实验分组分别换液，继续培养。换液的时间记为0 h，在培养的24，48，72 h，分别向E2组、溶剂对照组、空白对照组按照10 μL/孔加入MTS试剂，孵育1～4 h，酶标仪于490 nm波长处检测吸光度(optical density,OD)值，以OD值表示细胞的增殖活性，其与活细胞的数量成正比。实验重复3次。
1.2.3 侵袭实验检测不同浓度E2作用24 h后细胞的侵袭能力 由上一步实验结果得到溶剂对照组与空白对照组之间差异无统计学意义，故后续实验均选择溶剂对照组作为实验的对照组。用Transwell小室模型，将matrigel基质胶1∶8稀释后铺于小室上室聚碳酸酯膜上模拟细胞外基质。小室的上室加入100 μL细胞悬液(1×105个/mL)，下室加入600 μL完全培养基，设3个平行小室。置于培养箱中孵育24 h后，磷酸缓冲盐溶液洗膜，棉拭子擦净上室内细胞，甲醛固定30 min，结晶紫染色20 min，自来水轻轻冲洗1～2 min，显微镜下计数穿过膜的细胞。实验重复3次。
1.2.4 Western blot法检测不同浓度E2作用后ES2细胞中ARID1A、p53、MMP9蛋白的表达 E2组及对照组作用ES2细胞48，72 h后，收集各组细胞，加入蛋白裂解液，超声细胞粉碎机裂解细胞提取细胞总蛋白，Nanodrop进行蛋白定量。采用10% 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，电转移装置将凝胶上的蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别加入一抗ARID1A(1∶500)，MMP-9(1∶1 000)，p53(1∶1 000)，β-actin(1∶5 000)， 4 ℃孵育过夜，含0.05% Tween-20的Tris-HCl 缓冲盐溶液洗膜3次，每次10 min，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(1∶5 000)二抗，室温孵育2 h，含0.05% Tween-20的Tris-HCl 缓冲盐溶液洗膜3次，增强化学发光法显色。应用Image J图像分析软件进行蛋白灰度值分析，得到E2组及对照组ARID1A、p53、MMP-9蛋白的相对表达水平。实验重复3次。
1.3 统计学方法 应用SPSS 21.0统计软件分析数据。计量资料比较分别采用F检验和SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 不同浓度E2作用后ES2细胞的增殖活性的比较 E2作用24、48、72 h时，E2各浓度组细胞的增殖活性均高于溶剂对照组和空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。
表1 不同浓度E2作用不同时间后ES2细胞增殖能力比较
Table 1 Effects of different concentration of E2 on the roliferation of ES2 cells at different times were analyzed by MTS 
值)
组别 24 h 48 h 72 h E2 10-7 mol/L组1.043±0.042∗#1.784±0.078∗#1.834±0.094∗#E2 10-8 mol/L组1.016±0.022∗#1.521±0.068∗#1.659±0.027∗#E2 10-9 mol/L组1.017±0.052∗#1.376±0.073∗#1.366±0.065∗#E2 10-10 mol/L组0.983±0.016∗#1.223±0.041∗#1.187±0.036∗#E2 10-11 mol/L组0.964±0.027∗#1.045±0.076∗#0.917±0.054∗#溶剂对照组 0.602±0.0400.730±0.0280.725±0.093空白对照组 0.566±0.0150.731±0.0230.720±0.093F值 151.502 173.554 153.698 P值 0.000 0.000 0.000
*P值<0.05与空白对照组比较 #P值<0.05与溶剂对照组比较(SNK-q检验)
2.2 不同浓度E2作用后各组细胞侵袭能力比较 Transwell侵袭实验检测显示，E2各浓度组穿膜细胞数明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。
2.3 不同浓度E2作用后各组细胞中ARID1A、p53、MMP-9蛋白表达水平的比较 Western blot法检测显示，ARID1A的表达随着E2浓度的升高而逐渐降低，MMP9和p53蛋白的表达随着E2浓度的升高而增加(图1，2)。
表2 Transwell小室检测不同浓度E2处理后穿膜细胞数
Table 2 The number of cells that passed through the membrance of transwell migration assay and invasion assay in different concentration of E2 
个)
组别穿膜细胞数E2 10-7 mol/L组16.33±2.88∗E2 10-8 mol/L组12.66±1.52∗E2 10-9 mol/L组12.33±0.57∗E2 10-10 mol/L组10.66±0.57∗E2 10-11 mol/L组9.66±0.57∗对照组5.66±0.57F值 18.216P值 0.000
*P值<0.05 与对照组比较(SNK-q检验)
图1 不同浓度E2及对照组作用48 h后ES2细胞ARID1A、p53、MMP-9蛋白的表达
Figure 1 The expression of ARID1A，p53 and MMP-9 protein in ES2 cells treated with different concentration of E2 at 48 h
图2 不同浓度E2及对照组作用72 h后ES2细胞ARID1A、p53、MMP-9蛋白的表达
Figure 2 The expression of ARID1A，p53 and MMP-9 protein in ES2 cells treated with different concentration of E2 at 72 h
3 讨 论
卵巢透明细胞癌恶性程度高，手术切除卵巢或化疗使卵巢功能受损导致未绝经女性发生医源性绝经。患者出现严重的潮热、出汗、泌尿生殖道萎缩症状，并且增加心血管疾病、骨质疏松、情感障碍和痴呆的风险，MHT可改善绝经症状，降低心血管疾病和骨质疏松相关骨折的发生风险，提高患者生活质量。因此，应用MHT的获益是显著的，但是否所有的卵巢癌患者术后均能够进行MHT，目前尚存争议。Eeles等[3]研究结果显示，应用MHT组的患者总生存期和无进展生存期均优于未使用MHT患者，卵巢癌术后患者有严重的更年期症状，可以安全地应用MHT。然而，也有研究显示，无孕激素拮抗者应用雌激素易引起内膜异位症恶变[4]。本研究从体外实验分析雌激素与卵巢透明细胞癌细胞增殖侵袭的关系。正常妇女血清E2浓度为10-9～10-10 mol/L，故设计以涵盖正常浓度在内的10-7～10-11mol/L浓度梯度处理细胞。结果发现，随着E2浓度升高，ES2细胞的增殖侵袭能力增强，提示卵巢透明细胞癌术后患者使用雌激素治疗时应慎重。而雌激素与孕激素联合应用以及相关的动物体内实验还有待进一步研究。
ARID1A 是一个参与染色体重塑的抑癌基因，该基因正常表达在抑制细胞增殖及肿瘤生长中发挥着重要作用[5]。多种恶性肿瘤中存在着ARID1A基因突变，如胃癌、宫颈癌、子宫内膜癌等[6-10]。卵巢透明细胞癌中ARID1A 基因突变比例为 46%～57%[11]。有研究表明，ARID1A 基因突变会使患者无进展生存期缩短[12]。恶性肿瘤的局部浸润和远处播散涉及上皮、内皮下基底膜降解和细胞外基质的改变[13-14]，基底膜的完整性破坏被认为是恶性肿瘤侵袭开始的一个标志。MMP在恶性肿瘤细胞通过降解细胞外基质蛋白而浸润转移的过程中发挥着重要作用，其中MMP-9是降解细胞外基质中Ⅳ、Ⅴ型胶原和明胶的主要蛋白酶，过表达MMP-9将使恶性肿瘤细胞降解细胞外基质的能力增强，从而促进肿瘤的浸润、转移和血管生成[15]。p53是最早发现的抑癌基因，在肺癌、乳腺癌、卵巢癌等多种肿瘤中存在突变[16-19]。本研究结果显示，随着E2浓度升高， ES2细胞中ARID1A蛋白表达降低，MMP-9、p53蛋白表达增加，呈现剂量依赖性。由此推测，E2作用于ES2细胞后，可能对ARID1A等基因存在影响。有研究发现 ARID1A与p53存在相互作用[20]。本研究结果也显示，ES2细胞中ARID1A与p53、MMP-9蛋白的表达呈反向改变，提示ARID1A与p53、MMP-9之间可能存在相互作用，但其作用机制仍需进一步探讨。
综上所述，卵巢癌术后患者应用MHT是否会引起卵巢癌残余病灶转移复发，尚缺乏大样本循证医学证据，在卵巢癌患者进行MHT前应综合考虑年龄和肿瘤组织病理学类型、分级、分期等因素，并权衡MHT的益处以及刺激肿瘤生长和复发的危险性。
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