人类对肿瘤的研究过程中，借助动物模型可以模拟肿瘤组织在人体的发生发展、肿瘤与人体内环境的相互作用、各种信号的传递机制、新型药物的抑瘤效果和代谢过程等，故构建各种人类肿瘤的动物模型是肿瘤研究的平台之一，对探究肿瘤的发生、浸润、转移机制、研究新的治疗模式具有重要意义。本研究应用人卵巢癌黏液性腺细胞株3AO，以裸鼠为宿主，成功构建卵巢癌原位移植模型，并对动物模型的转归进行了观察和分析，报告如下。
1 材 料 与 方 法
1.1 材料
1.1.1 细胞 人卵巢黏液性腺癌细胞株3AO来自山东大学齐鲁医院生物中心。
1.1.2 动物 BALB/C(nu/nu)鼠30只，4～6周龄，雌性，体重18～20 g，购于中国医学科学院实验动物中心，恒温25 ℃、恒湿45%～50%、无特定病原体(specific pathogen free，SPF)条件下饲养于河北省实验动物中心。
1.1.3 试剂 RPMI1640培养液、胰蛋白酶购于美国Gibco公司，PBS、胎牛血清购自杭州四季青生物制品有限公司，生物蛋白胶购自杭州普济医药技术开发有限公司，氯胺酮购自江苏恒瑞医药股份有限公司。人糖类抗原CA125抗体(鼠单克隆)购于美国abcam公司，鼠免疫组织化学SP试剂盒、DAB试剂购于中杉金桥生物试剂有限公司。手术用纤维器械(持针镊、眼科镊、弹簧剪等)购自北京普莱克松科技有限公司，5-0、3-0可吸收缝线购自山东博达医疗器械用品股份有限公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 人卵巢黏液性腺癌细胞株3AO培养于RPMI 1640完全培养基，含10%热灭活胎牛血清，青霉素100 U/mL，链霉素100 U/mL，在37 ℃、5%CO2培养箱中培养，每日更换培养液，每4 d以0.1%胰蛋白酶溶液消化传代。细胞处于对数生长期时，将细胞消化、2 000 r/min离心，计数活细胞数量后重悬于无血清RPMI 1640培养基中，配制成每0.1 mL含1×107细胞的悬液。
1.2.2 卵巢原位移植瘤模型的构建 BALB/C(nu/nu)鼠以1%氯胺酮100 mg/kg腹腔注射麻醉后，置于超净台于无菌操作板上，将其俯卧位固定，背部皮肤备皮、消毒，铺洞巾，自背部正中向右旁开1 cm、髂嵴上缘行1 cm纵切口，剪开皮肤、皮下组织、肌肉，提夹腹膜，剪开，进入腹腔，切口下为右肾下缘，于其下方找到右卵巢，固定，将0.1 mL细胞悬液注射于卵巢深部，压迫1 min，生物蛋白胶封闭注射孔，以5-0可吸收缝线缝合腹膜，3-0可吸收缝线间断缝合皮下组织、皮肤，再次消毒术野，术毕。
1.2.3 模型鼠的一般观察 术后继续SPF饲养，每日观察模型鼠精神状态、进食、大小便、活动情况，每周测量体重、检查腹部情况。
1.2.4 模型鼠的病理学检查 自建模后第3周开始，每周脱颈处死5只模型鼠，连续6周。对模型鼠进行仔细解剖，记录瘤体径线、重量、形态，计算瘤体体积；记录腹腔积液量、腹腔积液性状；记录盆腔、腹腔、胸腔各脏器浸润转移情况、淋巴结受累情况。各组织取材后迅速以10%中性福尔马林固定，脱水后制作石蜡切片，苏木素-伊红染色，光镜下观察细胞形态、分型、分级；进行免疫组织化学SP法染色，观察糖类抗原CA125的着色强度、着色部位及着色比例，以PBS为一抗进行阴性对照，以人卵巢黏液性腺癌阳性切片为阳性对照。
2 结 果
2.1 人卵巢黏液性腺癌细胞株3AO的生长情况 人卵巢黏液性腺癌细胞株3AO为贴壁生长，细胞呈梭形，体积大小不等，胞浆半透明，较少，核圆形或椭圆形，核浆比例大，核仁较大。细胞多为单核，偶见双核及瘤巨细胞。有丝分裂相多见。细胞铺满瓶底后有重叠现象，呈复层生长。细胞指数增殖期为2～6 d。人糖类抗原CA125呈阳性表达，着色部位定位于细胞浆，可见黄色、棕黄色染色(图1)。
2.2 模型鼠的一般情况 自移植后第3周起，模型鼠活动减少、反应迟钝，逐渐出现消瘦、进食少、腹部胀大、活动受限等情况。
2.3 模型鼠的组织学检查
2.3.1 大体表现 第3周处死模型鼠，有3只右卵巢可见轻度增大，呈白色实性结节状，2只外观无明显变化，周围脏器无变化。第4周5只均形成球形实性结节，长径0.8～1.2 cm，质韧，对侧卵巢及周围脏器外观无异常。自第5周起，肿瘤逐渐侵及对侧卵巢、肠管、肝脾、肾、肺、淋巴结等器官(图2)，有无色透明腹腔积液形成，1～3 mL。有4只模型鼠未成瘤，无转移灶形成。成瘤率为86.67%。
2.3.2 光镜表现 石蜡切片HE染色观察，移植侧结节均为核大、深染的瘤细胞，核浆比例增大。细胞弥漫分布或呈团块状分布，偶有腺样结构形成。符合人卵巢黏液性腺癌细胞表现。各器官转移灶瘤细胞性状与移植侧卵巢结节相同(图3)。
2.3.3 免疫组织化学表现 人糖类抗原CA125呈阳性或强阳性表达，着色部位定位于细胞浆，可见黄色、棕黄色染色。各器官转移灶瘤细胞性状与移植侧卵巢结节相同(图4)。
图1 人卵巢癌黏液性腺癌细胞株3AO(IH ×100)
Figure 1 Human ovarian mucinous cystadenocarcinoma cell line 3AO(IH ×100)
图2 原位移植后7周，右卵巢肿瘤结节，肠管、肝脏转移灶
Figure 2 Tumor mass in right ovary and metastasis in intestines,liver at 7 weeks after transplantation
图3 右卵巢肿瘤组织免疫组织化学染色，CA125在细胞浆表达(IH ×400)
Figure 3 Pathological examination of tumor in right ovary,CA125 was expressed in cytoplasm(IH ×400)
图4 淋巴结转移灶(HE ×100)
Figure 4 Metastatic lesion in lymph nodes (HE ×100)
3 讨 论
在女性生殖系统疾病中，卵巢癌是三类恶性肿瘤之一，病死率高居首位。虽然可能有遗传、免疫、代谢、基因突变等多种原因，但大多数患者尚无明确病因，难以提前预防[1-2]。因卵巢在盆腔位置深在，早期发病无明显症状，下腹隐痛、腹胀、腰骶部酸胀下坠等症状不特异，导致大多数患者晚期出现腹腔积液、消瘦、乏力时才被确诊[3]。多年来，研究者们相继发现了有效药物，如铂类、紫杉醇类等，乃至靶向治疗等，但患者的5年生存率仍处于30%水平[4-6]。因此，建立多种卵巢癌动物模型，研究卵巢癌在机体的生长增殖、浸润转移，继而尝试新药物新疗法，有着重要意义。
某种动物模型与人类疾病发生、发展、转移的自然过程是否存在相似性，直接影响实验的结果和推论，故建立和采用适宜的动物模型是每项实验的重要前提。是自1977年世界第1例肿瘤动物模型构建成功以来，人们对肿瘤的研究迈入了新的阶段[7-8]。通过动物模拟人类机体，更贴近了肿瘤在人体的发生发展过程，比单纯的体外实验更进一步。动物的肿瘤建模方式有皮下移植瘤模型、腹腔移植瘤模型、原位移植瘤模型、尾静脉注射移植瘤模型等。尾静脉注射移植瘤主要用于血液系统肿瘤的模型构建，用于实体瘤模型时，移植的细胞弥散，形成人为种植灶，与人卵巢癌局部生长继发盆腹腔转移的模式相去甚远，一般不予采用[9]。其余3种方式可用于实体瘤的模型构建。皮下移植瘤模型是将肿瘤细胞或组织块种植于动物皮下，比较直观，便于观察肿瘤生长情况，但受皮下组织结构和血供影响，成瘤率差别不一，也不能模拟卵巢癌在腹腔内生长、转移的生物学行为。这种模型主要用于了解肿瘤细胞的增殖情况，转移少见，偶可见肺部转移，与人卵巢癌的肿瘤行为不同。腹腔移植瘤模型是将肿瘤细胞注入动物腹腔，细胞播散广，腹膜及腹腔脏器血供丰富，易于成瘤。此种模型与肿瘤广泛播散转移、腹腔积液形成、临床症状有很大相似性，适用于此方向研究，但对肿瘤从原发部位生长到广泛转移之间的过程无法模拟。相比之下，原位移植瘤模型是将肿瘤细胞或组织块种植在相应器官，以观察肿瘤生长的自然过程及从局部生长到多脏器转移、腹腔积液形成、恶液质的发展过程，较好地模拟了肿瘤的生物学行为[10-11]。
在卵巢癌方面，皮下移植和腹腔移植模型应用较早较广泛。因动物卵巢体积小、位置深，将肿瘤细胞或组织块种植在卵巢原位比较困难，故发展较慢。卵巢癌原位移植瘤模型的建模方法有卵巢原位细胞悬液注射法和卵巢原位组织块移植法2种。卵巢原位细胞悬液注射法是将培养到指数生长期的肿瘤细胞悬液直接注入到卵巢实质中，细胞分布于组织间隙，与周围组织细胞建立细胞连接，从而获得营养供应得以生长、分裂、繁殖；造模过程中可能出现卵巢贯通、针孔溢液、肿瘤细胞播散等情况，也有出现细胞死亡、造模失败的可能。卵巢原位组织块移植法是将肿瘤细胞先注入动物皮下组织中，构建皮下移植瘤模型，之后再将皮下移植瘤取出，制作成组织块(体积约1 mm3)，移植入卵巢皮质中；因组织块中已具备肿瘤细胞、组织间质、血管、淋巴管等固有结构，与周围卵巢组织内的相应结构连接融合后即可生长；但因为卵巢体积小，操作过程要求精细，手术器械的选择要求较高，操作不满意可能导致卵巢组织出血、损伤等情况，影响造模成功率。
国际上最早是1993年由Fu等[12]将人卵巢癌组织块种植于裸鼠表面，观察到裸鼠出现腹腔积液和腹腔转移灶。国内李静等[13]在2003年建立了人卵巢癌细胞株SW626皮下移植瘤模型，再将皮下移植瘤制作组织块，经裸鼠腹部切口种植于卵巢，构建了卵巢原位移植模型，移植35只，成功率为91.4%，移植侧卵巢被肿瘤浸润形成包块，转移至对侧卵巢、盆腹膜、盆腹腔器官、淋巴结。此后，学者们相继自腹部入路、背部入路建立了人卵巢癌株SKOV3、ES-2、HP8910的裸鼠原位移植模型[14-15]，拓宽了研究领域。
本研究采用的人卵巢黏液性囊腺癌细胞株3AO，是取自一位黑人卵巢癌女性的腹腔积液细胞建株，遗传学特征稳定[16]，被国际公认和广泛使用，但尚未有卵巢原位移植模型的报道。本实验操作方法简单，麻醉剂腹腔注射，可按照动物情况和实验时间调整用量；动物建模选用背部小切口，创伤小，无出血；解剖层次清楚，位置准确；使用生物蛋白胶封堵穿刺针孔，杜绝了细胞悬液外漏导致细胞播散种植于卵巢周围的情况，并且进一步保障了卵巢实质内的细胞数量，保证了成瘤率。随着观察时间的延长，肿瘤由卵巢局部生长发展到对侧卵巢及多脏器转移，该模型与人卵巢癌的生物学行为类似，能模拟卵巢癌发生发展的自然进程，可以作为进行人卵巢癌研究的体内模型，是一种较为实用的模型工具。
[1] Starbuck K,Al-Alem L,Eavarone DA,et al. Treatment of ovarian cancer by targeting the tumor stem cell-associated carbohydrate antigen,Sialyl-Thomsen-nouveau[J]. Oncotarget,2018,9(33):23289-23305.
[2] Kotsopoulos J,Gronwald J,Karlan B,et al. Age-specific ovarian cancer risks among women with a BRCA1 or BRCA2 mutation[J]. Gynecol Oncol,2018,150(1):85-91.
[3] Tomar TS,Nair RP,Sambasivan S,et al. Role of laparoscopy in predicting surgical outcomes in patients undergoing interval cytoreduction surgery for advanced ovarian carcinoma:a prospective validation study[J]. Indian J Cancer,2017,54(3):550-555.
[4] Lindemann K,Gao B,Mapagu C,et al. Response rates to second-line platinum-based therapy in ovarian cancer patients challenge the clinical definition of platinum resistance[J]. Gynecol Oncol,2018,150(2):239-246.
[5] Han Y,Chen MK,Wang HL,et al.Synergism of PARP inhibitor fluzoparib(HS10160) and MET inhibitor HS10241 in breast andovarian cancer cells[J]. Am J Cancer Res,2019,9(3):608-618.
[6] Nakatani M,Watari H,Mitamura T,et al. The anti-tumor effect of cabozantinib on ovarian clear cell carcinoma in vitro and in vivo[J]. Anticancer Res,2017,37(11):6125-6132.
[7] Davy M,Mossige J,Johannessen JV. Heterologous growth of human ovarian cancer. A new in vivo testing system[J]. Acta Obstet Gynecol Scand,1977,56(1):55-59.
[8] Padmanabhan S,Waly MI,Taranikanti V,et al.Folate/vitamin B12 supplementation combats oxidative stress-associated carcinogenesis in a rat model of colon cancer[J]. Nutr Cancer,2019,71(1):100-110.
[9] Shahzad KA,Wan X,Zhang L,et al.On-target and direct modulation of alloreactive T cells by a nanoparticle carrying MHC alloantigen,regulatory molecules and CD47 in a murine model of alloskin transplantation[J]. Drug Deliv,2018,25(1):703-715.
[10] Ataie-Kachoie P,Pillai K,Badar S,et al. Monepantel considerably enhances the therapeutic potentials of PEGylated liposomal doxorubicin and gemcitabine in ovarian cancer:in vitro and in vivo studies[J]. Am J Cancer Res,2018,8(10):2064-2075.
[11] Roque-Lima B,Roque CCTA,Begnami MD,et al. Development of patient-derived orthotopic xenografts from metastatic colorectal cancer in nude mice[J]. J Drug Target,2018,5:1-7.
[12] Fu X,Hoffman RM. Human ovarian carcinoma metastasis models constructed in nude mice by orthotopic transplantation of histologically-intact patients specimens[J]. Anticancer Res,1993,13(2):283-288.
[13] 李静,邢辉,高庆蕾,等.人卵巢癌裸鼠原位移植瘤模型的建立及生物学特性研究[J].中华妇产科杂志,2003,38(6):376-378.
[14] 詹光熙,彭书敏,美丽古丽·莫合买提,等.人卵巢癌裸鼠原位移植瘤模型的构建[J].石河子大学学报：自然科学版,2017,35(5):574-579.
[15] 郭秀霞,唐才德,臧文华,等.人卵巢癌HO-8910原位移植瘤动物模型建立及分期研究[J].南京中医药大学学报,2016,32(4):356-358，382.
[16] 司徒镇强.细胞培养[M].北京:世界图文出版公司,2000：96.