泻白散为宋代儿科专家钱乙所创，又名泻肺散，为儿科名方，启脏腑辨证之先河，主治小儿肺盛，气急咳喘[1]。泻白糖浆是在泻白散的基础上加减药味而成，组方为石膏、桑白皮、瓜蒌子、葶苈子、麻黄、甘草、前胡、紫菀、款冬花、川贝母、苦杏仁、紫苏叶油和薄荷脑，有宣肺清热、化痰止咳的作用，可用于伤风咳嗽、痰多胸满、口渴舌干、鼻塞不通。目前，对于该复方制剂的作用途径和作用靶点的研究尚未有文献报道。网络药理学作为近年出现的一门新兴学科，融合了系统生物学、多向药理学、计算生物学、网络分析等多学科的技术和内容，将生物学网络与药物作用网络整合，探究疾病及药物的相互作用机制，与复杂疾病的治疗理念相吻合[2]，已被广泛用于中药潜在活性成分和作用靶点的预测及中药作用机制的阐述[3]。本研究旨在通过网络药理学分析平台筛选出泻白糖浆的活性成分与作用靶点，通过核心靶点进行基因本体(gene ontology,GO)通路富集分析，探讨其治疗肺盛咳喘的作用机制，为其在临床的使用提供理论依据。
1 材 料 与 方 法
1.1 材料 网络药理学实验研究的主要材料是数据库和软件，主要包括PubChem(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库、Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)数据库、中药系统药理学数据库和分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)、STITCH(http://stitch.embl.de/)数据库、Genetic Association Database(GAD)(http://geneticassociationdb.nih.gov/)数据库、Therapeutic Target Database(TTD)(https://db.idrblab.org/ttd/)数据库、遗传药理学与药物基因组学数据库(Pharmacogenetics and Pharmacogenomics Knowledge Base, PharmGKB)(http://geneticassociationdb.nih.gov/)、Uniprot(http://www.uniprot.org/)数据库、Metascape(http://metascape.org)数据库，Cytoscape 3.7.1软件。
1.2 方法
1.2.1 活性成分的筛选 运用TCMSP检索泻白糖浆中各单方药材，构建成分数据库，结合药物在体内的吸收、分布、代谢、排泄的相关性质及TCMSP中建议的筛选标准，以口服生物利用度≥30%和药物相似性≥ 0.18为限制进行筛选，然后分别通过泻白糖浆、葶苈子、麻黄、甘草、紫菀、款冬花、川贝母、苦杏仁等[4-11]关键词检索中国知网、万方数据、Pubmed(http://pubmed.cn/)、Ovid(http://ovid.cn/)数据库，查找文献中有明确与治疗咳嗽相关药理活性的成分。综合以上成分，得到最终活性成分数据库。
1.2.2 活性成分靶点基因的预测 将选取的活性成分通过Swiss Target Prediction数据库和STITCH平台进行活性成分作用靶点的预测。首先登录PubChem服务器，找到泻白糖浆主要活性成分的Canonical SMIL信息，然后在Swiss Target Prediction数据库中上传主要活性成分的Canonical SMILES，结合已知配体的二维和三维相似性度量，每个活性成分取排名前10的靶点。此外，将选取的活性成分导入STITCH数据库进行活性靶点预测，每个活性成分取排名前10的靶点。综合所有活性成分相关靶点信息，去除重复靶点，得到泻白糖浆所有活性成分靶点。检索到的靶点经UniProt数据库进行转换，校正为该靶点的官方简写。
1.2.3 疾病靶点基因的获取 泻白糖浆具有宣肺清热、化痰止咳的作用，可用于伤风咳嗽、痰多胸满、口渴舌干、鼻塞不通。以咳嗽为关键词分别检索TTD数据库、GAD数据库和PharmGkb数据库，找到与咳嗽相关的疾病靶点，使用UniProt数据库进行基因名转换，综合3个数据库的检索结果并去除重复基因，得到疾病对应的靶点基因。
1.2.4 蛋白质相互作用网络的构建与核心靶点的筛选 分别将活性成分和疾病获得的靶点信息以“txt”文件格式导入Cytoscape 3.7.1软件，利用软件中BisoGenet插件，查找与成分靶点基因和疾病靶点基因相互作用的蛋白质，形成蛋白质相互作用网络。使用软件中的“Merge”功能对成分靶点和疾病靶点取交集，整理数据，以“degree”为筛选指标，选取>2倍中位数值的靶点，即得到核心靶点。
1.2.5 靶点通路注释分析 将得到的核心靶点导入Metascape数据库中，选择对应的物种“H.sapinens”，就可以得到靶点的GO分类富集分析。GO有3个分类:①细胞组分，指基因产物位于何种细胞器或基因产物组中(如糙面内质网、核或核糖体和蛋白酶体等)，表明基因产物在什么地方起作用；②分子功能，描述基因产物在分子生物学上的活性，如催化活性或结合活性；③生物学过程，指由分子功能有序组成的，具有多个步骤的一个过程[12]。
2 结 果
2.1 活性成分与成分靶点 泻白糖浆经检索和筛选共得到238个活性成分，包括桑白皮24个，葶苈子12个，前胡24个，麻黄6个，款冬花26个，川贝母13个，紫菀19个，苦杏仁8个，瓜蒌14个，甘草92个。文献报道的有明确药理活性的成分共18个，分别为绿原酸、东莨菪内酯、桑皮苷A、栝楼仁二醇、款冬酮、款冬花素、芥子苷、麻黄碱、伪麻黄碱、甘草次酸、白花前胡甲素、白花前胡乙素、紫苑酮、表木栓醇、苦杏仁苷、紫苏醛、西贝素、贝母素甲。对以上活性成分进行靶点预测，共得到560个靶点基因。
2.2 疾病靶点基因的预测 在TTD、GAD、PharmGKB 3个数据库中分别找到7个、5个、3个与咳嗽相关的靶点基因，共得到15个疾病靶点基因，去除重复基因，最终得到14个疾病靶点基因。
2.3 蛋白质相互作用网络的构建与核心靶点基因的筛选 机体内部的蛋白相互作用网络是一个非常复杂的网络，一种生物活性成分可能作用于多个信号靶点，一个靶点也可能连接多个信号通路与多个生物活性成分发生相互作用，故药物中的多个活性成分在体内发挥治疗作用的过程显得更为复杂与多样化。蛋白质相互作用网络(PPI拓扑网络)是为药物与疾病之间建立联系的关键，通过这个网络可以找寻药物的作用靶点和治疗疾病的相关靶点，从而为药物治疗疾病提供依据。构建的拓扑分析结果发现，泻白糖浆中的活性成分靶点基因可以与6 746个靶点发生相互作用，疾病靶点基因可以与211个靶点发生关联，将以上2个数据“Merge”取交集，得到180个既与药物相关又与疾病相关的靶点。degree值表示一个靶点与其他靶点相连的数目，degree值越大，得到的靶点可信度越高。将Merge后的靶点以“degree”为筛选指标，得到>2倍中位数的靶点54个，称为核心靶点基因(图1)。
图1 核心靶点网络图
Figure 1 Core targets network diagram
2.4 基因功能与通路分析 使用Metascape数据库对核心靶点基因进行GO分析(表1)。表中“通路”表示基因通过标识号对应或者序列注释方法找到的与之对应的生物过程；“通路名称”是对相应生物过程的具体说明；“基因数量”表示提供的基因列表中具有参与特定通路的基因数量；P值由累积超几何分布计算而得，P值越小，表示这个通路中富集的差异基因越多，“Log10(P)”是以10为底P值的对数，“Log10(q)”是以10为底多次测试调整后的P值的对数。由GO通路分析结果可以看出，核心靶点基因与生物体免疫反应激活信号转导、内质网应激反应和凝血等生物过程关系密切。
表1 排名前20位具有代表性的富集通路
Table 1 Top 20 clusters with their representative enriched terms
通路通路名称基因数量Log10(P)Log10(q)M124PID CXCR4通路10-13.90-9.68GO:0007596凝血13-12.75-9.18M13PID ERBB4通路7-11.83-8.62GO:0002757免疫反应激活信号转导15-11.61-8.44GO:0051222蛋白转运的正向调节12-10.46-7.57GO:2000116半胱氨酸内肽酶的活性调节10-10.32-7.47GO:0030100胞吞作用的调节10-9.59-6.88M214PID ERBB1内化通路6-9.56-6.85GO:0018105肽酰丝氨酸磷酸化10-9.40-6.75GO:0071417细胞对有机氮化物的反应11-7.58-5.27GO:0043161蛋白酶体介导的泛素依赖蛋白分解代谢过程9-6.72-4.58GO:0006913核质转运8-6.32-4.24GO:1905114细胞表面受体信号通路参与的细胞间信号传导10-6.24-4.19GO:0001678细胞葡萄糖稳态6-6.10-4.08GO:0035690细胞的药物反应8-6.06-4.06GO:0034976内质网应激反应7-5.78-3.82GO:0038003阿片类受体信号通路3-5.72-3.78R-HSA-1660499质膜上PIPs的合成4-5.32-3.43GO:0036465突触小泡再循环4-4.89-3.08R-HSA-901042Calnexin/Calreticulin循环3-4.65-2.89
3 讨 论
药物发现的主导方式是设计最大选择性配体以作用于个体药物靶标，然而，许多药物通过调节多种蛋白质靶点而非单一靶点起作用，与多靶点药物比较，精选的化合物可能表现出低于所预估的临床疗效。网络药理学综合了系统生物学、多项药理学、生物信息学和计算机科学等多种学科的内容和技术，对药物的成分、作用靶点、作用机制等进行全面多角度的考察和分析[13]，通过整合药物作用网络和生物学网络，找寻药物在整个网络体系中发挥作用的靶点。网络药理学的应用打破了对中药研究的瓶颈，为中药的研究带来了一个新的机遇。本研究在药味活性成分的选取过程中，除了利用中药系统药理学数据库和分析平台TCMSP中的口服生物利用度和类药性选取原则，还结合文献报道的有明确与治疗咳嗽相关的药理活性成分，如绿原酸、麻黄碱、苦杏仁苷等。泻白糖浆是在泻白散的基础上加减药味而成，泻白散为宋代儿科专家钱乙所创，出自《小儿药证直决》，临床常用于治疗小儿麻疹初期、肺炎或支气管炎等。在宋代，并没有肺炎、支气管炎之说，肺主气，宜清肃下降，火热郁结于肺，则气逆不降而为喘咳，故泻白糖浆主治肺有伏火郁热者，清泻肺中郁热，以达到止咳平喘的作用。
分析得到的通路可以发现，泻白糖浆发挥治疗咳嗽的作用与“免疫反应激活信号转导”这一生物过程密切相关。现代中医认为，阴虚肺热是先天禀赋不足、六淫侵袭、七情太过、饮食失调和药物损伤等原因引起的[14]。先天禀赋不足在西医中可以理解为免疫力低下，抵抗能力弱，更容易感染病毒与细菌，泻白糖浆可以通过激活机体的免疫反应达到增强自身免疫力治疗咳嗽的目的。此外，泻白糖浆对“内质网应激反应”这一生物过程也有重要的影响作用。内质网中未折叠或错误折叠蛋白的增多会引起内质网应激，内质网通过减少蛋白质翻译、诱导分子伴侣以及相关蛋白表达上调、增加错误折叠蛋白降解等途径，使内质网恢复稳态，这些变化统称为内质网应激反应。已有报道表明，内质网应激与机体内的多类免疫疾病及炎症疾病有关[15]，临床用泻白糖浆治疗肺炎和支气管炎[16]，由这一通路分析可以得到理论验证支持。
中药复方由2味或2味以上中药配伍而成，具有化学成分复杂，作用靶点繁多的特点。由于中药复方的复杂性，使得中药的药效物质基础和作用机制的研究缺乏科学、合理、有效和安全的评价体系[17]。本研究利用网络药理学分析平台和数据库对泻白糖浆中治疗咳嗽的靶点与作用通路进行了简单预测，初步阐释了临床治疗咳嗽、肺炎等疾病的合理性，为泻白糖浆的作用机制研究提供了一定参考。但研究结果欠缺实验数据的支持，如需对泻白糖浆的作用机制作进一步考察。
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