近年来，甲状腺癌成为发病率增长速度最快的癌症之一，中国每年新发病例约50 000例，并呈现逐年上升的趋势[1]。甲状腺癌作为临床上最常见的恶性肿瘤之一，其发病率虽然较高，但其临床预后较好，10年生存率超过90%[2]，超过90%的甲状腺癌为分化型甲状腺癌(differentiated thyroid carcinoma，DTC)，部分DTC患者会发生肺和骨转移[3]，且发生转移的DTC患者，其10年生存率显著降低至14%～21%[4]。肿瘤的转移是一个复杂的过程，主要涉及到细胞黏附、侵袭和血管生成等生物学行为[5]。趋化因子基质细胞衍生因子1(stromal cell-derived factor 1，SDF-1)是一种强有力的趋化因子，其高表达能促进通过内皮细胞屏障的迁移，可以调节造血干细胞在骨髓中的迁移[6]。研究表明，在肝细胞癌中SDF-1的高表达与血行转移、淋巴结转移和患者的预后不良密切相关[7]。SDF-1同样能通过介导肿瘤细胞的增殖和迁移，促进肿瘤相关血管生成，间接促进肿瘤转移[8]。另一个促进肿瘤细胞侵袭行为的因素是缺氧，缺氧可导致肿瘤微环境大量的适应性改变，并纠正缺氧所造成的氧缺乏症[9]。缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)是在缺氧感受与缺氧诱导方面发挥重要功能的转录因子，其不仅可增强缺氧状态下细胞的存活能力，还可促进细胞的黏附、迁移及促血管生成[10]。HIF-1α还可促进细胞向缺氧部位迁移，这种迁移涉及多种配体和受体间的相互作用，如HIF-1α的下游基因SDF-1[11]。已知HIF-1α和SDF-1在多种肿瘤转移过程中发挥重要作用，那么它们在DTC的转移中扮演着什么角色呢？本研究检测到HIF-1α和SDF-1在DTC转移与原位癌组织中的表达有差异，本研究旨在为进一步阐明DTC发生转移的分子机制提供理论基础。
1 资 料 与 方 法
1.1 一般资料 筛选2011年1月—2016年12月四川省自贡市第一人民医院病理检查确诊并已行甲状腺切除术的DTC患者52例，根据有无扩散或转移分为：原位癌组33例, 男性 15 例，女性 18 例，年龄16～76岁，平均(51.6±6.2)岁；转移癌组19例(颈部淋巴结转移3例，骨转移6例，肺转移5例，纵隔转移2例，肌肉转移2例，肾转移1例)，男性 8 例，女性11 例，年龄 27～79岁，平均(53.5±8.7)岁。取手术切除的原发灶肿瘤组织和距离病灶>2 cm的癌旁组织52例为对照组。原位癌组与转移癌组性别、年龄差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。
1.2 实验材料及来源 甲状腺癌细胞系SW579购自于中国科学院细胞库；实验所需的引物由上海生工生物技术有限公司合成；质粒转染试剂和Trizol Reagent来源于Invitrogen公司；逆转录试剂盒、荧光染料、QPCR实验相关耗材来源于北京天根公司；CCK-8试剂盒均购买于碧云天生物技术有限公司；Transwell小室购自美国Millipore公司。
1.3 实验方法
1.3.1 总RNA提取和实时荧光定量核酸扩增检测系统(Real-time Quantitative PCR Detecting System，QPCR)检测 组织或细胞提取总RNA后逆转录为cDNA，按说明书进行QPCR实验，以GADPH为内参照。以下为反应各引物序列：人HIF-1α引物序列Sense为5′-TAGCCGAGGAAGAACTATGAA-C-3′，Antisense为5′-CTGAGGTTGGTTACTGT-TGGTA-3′；SDF-1引物序列Sense为5′-CCGC-GCTCTGCCTCAGCGACGGGAAG-3′，Antisense为5′-CCTTGTTAAAGCTTTCTCCAGGTACT-3′；GADPH引物序列Sense为5′-ACCACAGTCCAT-GCCATCAC-3′，Antisense为5′-TCCACCACCC-TGTTGCTGTA-3′。每组3个重复，并设对照，用2-ΔΔCt法对结果进行分析。
1.3.2 细胞培养 将人甲状腺癌细胞系SW579于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的1640培养液中，在含5% CO2的37 ℃恒温箱中培养，收集对数期细胞进行实验。
1.3.3 HIF-1α-siRNA转染 将培养好的SW579细胞分成2组：HIF-1α干扰组即HIF-1α-siRNA组、si-NC组，利用LipofectamineTM RNAiMAX转染pcDNA3.1-HIF-1α-siRNA，pcDNA3.1-HIF-1α-NC质粒入SW579细胞，转染浓度为0.5 μg/mL。将细胞放入细胞培养箱中孵育6 h后，去掉培养板中旧的培养基，加入新鲜的完全培养基，并置于细胞培养箱中培养48 h，用于后续实验。
1.3.4 Western blot检测HIF-1α、SDF-1蛋白的表达 消化收集siRNA干扰后的细胞，利用RIPA试剂进行蛋白提取；BCA试剂盒进行蛋白定量。经SDS-PAGE电泳，转膜后，进行一抗孵育，HIF-1α(abcam公司，1∶1 000)、SDF-1(abcam公司，1∶1 000)、内参使用GAPDH抗体(abcam公司，1∶1 000)。一抗孵育后PBST洗膜10 min/次，洗3次，二抗使用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(abcam公司，1∶10 000)，最后进行ECL显色。
1.3.5 细胞增殖实验 将细胞消化为单细胞悬液，将细胞以每孔104个于96孔板上培养，每个样本3个重复，按照实验需求分为si-NC组、si-NC+SDF-1组、HIF-1α-siRNA组和HIF-1α-siRNA+SDF-1组，利用LipofectamineTM RNAiMAX转染siRNA和siNC，外源性加入0 ng/mL或100 ng/mL的SDF-1，将细胞在细胞培养箱中放置48 h后，96孔板中每个细胞孔加入CCK-8溶液10 μL，3 h后，酶标仪检测450 nm处的OD值。
1.3.6 细胞侵袭能力检测 分组处理同增殖实验。①将Matrige与1640培养液按1∶4的比例稀释，每个Transwell小室中均匀的铺60 μL Matrige。然后，小室放入37℃细胞培养箱内4 h使Matrige凝固。②将细胞培养48 h后，消化重悬后用5%FBS的1640培养液调整为5×103个/ mL的密度。③向每个小室加入200 μL细胞悬液，放入24孔板中(24孔板提前加入500 μL含20%FBS的1640培养液)，24 h后，取出小室。④PBS轻柔清洗2次，棉签轻柔拭去Transwell小室内层的细胞，放入24孔板内固定30 min(24孔板提前加有500 μL的4%多聚甲醛)，用棉签从侧面吸除多余的多聚甲醛。⑤再放入加有500 μL的0.1%结晶紫的24孔板内染色，10 min后取出Transwell小室用PBS反复漂洗至PBS澄清无色，然后风干。⑥200倍显微镜下拍照计5个视野，计算平均值。
1.4 统计学方法 应用SPSS 20.0统计软件分析数据。计量资料比较分别采用F检验和SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 各组HIF-1α和SDF-1转录表达水平比较 DTC患者切除组织中原位癌和转移癌HIF-1α和SDF-1的转录表达水平均显著高于癌旁组织(对照组)，转移癌组中HIF-1α和SDF-1的表达水平又高于原位癌组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。
表1 各组HIF-1α和SDF-1表达水平比较
Table 1 Compared of expression levels of HIF-1α and SDF-1 among groups 
组别例数HIF-1α表达SDF-1表达对照组 520.85±0.110.94±0.12原位癌组332.94±0.20∗2.24±0.24∗转移癌组194.37±0.41∗#4.72±0.56∗#F值 6.33117.033P值 0.0190.000
*P值<0.05与对照组比较 #P值<0.05与原位癌组比较(SNK-q检验)
2.2 各组SDF-1转录、细胞增殖和细胞侵袭力比较 HIF-1α-siRNA组和HIF-1α-siRNA+SDF-1组SDF-1转录水平低于si-NC组和si-NC+SDF-1组(P<0.05)，si-NC组与si-NC+SDF-1组之间、HIF-1α-siRNA组与HIF-1α-siRNA+SDF-1组之间SDF-1转录水平差异均无统计学意义(P>0.05), 同时HIF-1α-siRNA组SDF-1蛋白水平也低于Si-NC组(图1)。si-NC+SDF-1组细胞增殖和细胞侵袭力均高于si-NC组，HIF-1α-siRNA+SDF-1组细胞增殖和细胞侵袭力均低于si-NC组和si-NC+SDF-1组，但高于HIF-1α-siRNA组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。
表2 各组 SDF-1转录、细胞增殖和细胞侵袭力比较
Table 2 Compared of SDF-1 transcription，proliferation and invasiveness of cells among groups 
组别SDF-1mRNA转录细胞增殖细胞侵袭si-NC组2.81±0.350.73±0.03352.0±49.3si-NC+SDF-1组2.96±0.470.91±0.07∗499.7±40.6∗HIF-1α-siRNA组1.00±0.05∗#0.51±0.03∗#216.3±19.3∗#HIF-1α-siRNA+SDF-1组0.93±0.11∗#0.76±0.08#△329.7±27.7#△F值41.34224.93931.196P值0.0000.0000.000
*P值<0.05与si-NC组比较 #P值<0.05与si-NC+SDF-1组比较 △P值<0.05与HIF-1α-siRNA组比较(SNK-q检验)
图1 干扰HIF-1α后，HIF-1α和SDF-1蛋白表达变化
Figure 1 Expression changes of SDF-1 protein after interfering with HIF-1 α
3 讨 论
甲状腺癌发病率近年来呈现逐年增加趋势，而DTC占甲状腺癌的90%左右。作为临床上较常见的恶性肿瘤，虽然DTC的预后较好，但当DTC患者发生转移时，其预后往往会受到明显影响，并且生存率显著下降[4]。因此，研究DTC的侵袭及转移机制具有重要的临床指导意义。
肿瘤发生转移的机制很复杂，涉及到许多分子和信号通路。SDF-1属于趋化因子家族的成员，是近几年肿瘤相关研究的热点，其在多种癌症中表达，并与其受体结合从而激活下游相应通路，进而促进肿瘤细胞的侵袭、转移[12-13]。肿瘤细胞的生长往往需要适应缺氧环境，HIF-1α是在缺氧感受与缺氧诱导方面发挥重要功能的转录因子，其不仅可增强缺氧状态下细胞的存活能力，还可促进细胞的黏附、迁移及促血管生成[10]。国内外目前有关于HIF-1α或SDF-1单独与甲状腺癌转移的研究，但二者在DTC的转移过程中的关联尚未见报道。且HIF-1α和SDF-1在许多癌症中关系密切，如在胃癌中HIF-1α的表达与SDF-1密切相关，但二者的调节机制尚不清楚[14]。由此猜想HIF-1α和SDF-1在DTC转移的进程中是否相关呢？二者间的调节机制又是什么呢？首先本研究检测了52例DTC患者切除组织中HIF-1α和SDF-1的表达水平，结果显示二者无论是在原位癌组还是转移癌组中HIF-1α和SDF-1的表达水平均显著高于癌旁组织，转移癌组中表达HIF-1α和SDF-1的表达水平又显著高于原位癌组。表明HIF-1α和SDF-1在DTC中是呈现高表达的，并初步认为二者在DTC的转移进程中发挥某些作用。为了进一步明确二者在DTC转移过程中发挥的作用及二者相互作用的机制，本研究进行了体外实验验证。
首先，本研究在SW579细胞株中转染HIF-1α-siRNA，HIF-1α蛋白表达显著降低，证明HIF-1α干扰成功。干扰HIF-1α后，SDF-1的转录水平和蛋白表达量均显著下调，同时SW579细胞的增殖和侵袭能力与对照(si-NC组)相比也显著下降。HIF-1α在多种肿瘤中高表达，干扰HIF-1α后细胞增殖和细胞侵袭力明显降低，表明降低HIF-1α后其对SW579细胞的增殖和侵袭的促进作用被抑制，那么HIF-1α是通过SDF-1而发挥作用吗？为了进一步探究，本研究在SW579细胞株中加入了100 ng/mL的SDF-1(si-NC+SDF-1组)，结果显示其细胞增殖力和细胞侵袭力均较没有加入SDF-1的si-NC组增强，说明SDF-1本身是促进细胞增殖和细胞侵袭的；接下来对HIF-1α-siRNA组回补SDF-1，发现因干扰HIF-1α导致的细胞增殖和侵袭能力降低，在回补SDF-1后得到弥补，即HIF-1α-siRNA+SDF-1组细胞增殖和侵袭能力比HIF-1α-siRNA组显著升高(P<0.05)。表明HIF-1α是通过SDF-1对细胞增殖和侵袭发挥作用的。
有研究表明，缺氧状态下，HIF-1α可促进糖酵解，使肿瘤细胞能够存活并生长，并对癌细胞的代谢、增殖及转移等方面起调节作用[15]。趋化因子可影响肿瘤的生物学效应，在肿瘤的侵袭及转移过程中发挥着重要作用。SDF-1可与其特异性受体趋化因子受体4(chemokine receptor 4，CXCR4)结合后形成SDF-1/CXCR4轴，在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌等多种恶性肿瘤中起重要作用[16]。SDF-1的高表达，可诱导新血管形成及抵抗肿瘤细胞的凋亡，从而促进肿瘤细胞的增殖和调节肿瘤细胞的生长[17-18]。因此，本研究结合上述研究结果表明HIF-1α和SDF-1在肿瘤转移过程中发挥促进转移的作用。
在胃癌相关研究中发现，在缺氧状态下，HIF-1α表达上调可使SDF-1α的表达增加，从而促进胃癌细胞的迁移和侵袭[19]。SDF-1包括2种同分异构体SDF-1α和SDF-1β，二者由同一基因序列编码，两者的区别在于前者较后者少了4个3′氨基酸。SDF-1α可激活细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)信号通路，促进HIF-1α表达，增强软骨肉瘤细胞的侵袭。还有研究表明，促进HIF-1α的表达可通过SDF-1α发挥作用而诱导乳腺癌细胞的增殖[20]。而且SDF-1α高表达可促进HIF-1α表达，从而促进小细胞肺癌的转移。因此，本研究结果结合上述已有研究表明，HIF-1α和SDF-1在肿瘤的转移过程中有明确的相互关系，HIF-1α通过调控SDF-1发挥作用，但其具体相互作用机制仍不明确，有待进一步研究明确。
综上所述，HIF-1α和SDF-1在DTC肿瘤组织中高表达，且HIF-1α通过调控SDF-1在肿瘤细胞的转移过程中发挥重要的作用。
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